產(chǎn)耐熱木聚糖酶的芽胞桿菌的分離鑒定 畢業(yè)論文

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1、產(chǎn)耐熱木聚糖酶的芽胞桿菌的分離鑒定摘要：從地?zé)崴蟹蛛x到1株產(chǎn)木聚糖酶的菌株。酶學(xué)試驗(yàn)表明分離得到的菌株產(chǎn)生的木聚糖酶最適反應(yīng)條件為60℃，pH7—8，在80℃的條件下，孵育120min仍具有70％的活力，表明該酶具有較強(qiáng)的熱耐受性。通過菌落形態(tài)分析和革蘭氏染色鑒定確定該菌株為芽孢桿菌。關(guān)鍵詞：耐熱木聚糖酶，芽孢桿菌，革蘭氏染色半纖維素是重要的植物多糖成分，是世界上數(shù)量?jī)H次于纖維素的可再生資源。在自然界，分解半纖維多糖的微生物在半纖維素的循環(huán)再生利用中扮演著重要的角色（1-3）。木聚糖是半纖維素多聚糖家族的重要成員。木聚糖由呋喃木糖殘基通過β-1，

2、4糖苷鍵聚合成線性的多聚骨架（4-5）。微生物產(chǎn)生的木糖酶能將木聚糖水解成寡聚木糖和木糖（6）。由于木聚糖酶在半纖維多聚糖資源的利用以及工業(yè)應(yīng)用方面的巨大潛力使其成為研究和應(yīng)用領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。耐熱木聚糖酶在飼料工業(yè)，造紙業(yè)和印染工業(yè)中都有重要用途（7-11）。因而從自然界篩選產(chǎn)耐熱木聚糖酶的微生物是耐熱木聚糖酶的一個(gè)重要來源（12-13）。本試驗(yàn)采集地?zé)崴畼悠?，采用營(yíng)養(yǎng)體滅活的方法，篩選到產(chǎn)木聚糖酶的芽孢桿菌。對(duì)篩選的菌株的產(chǎn)酶特性進(jìn)行了研究，并且結(jié)合菌落形態(tài)分析和革蘭氏染色鑒定方法，確定篩選得到的產(chǎn)堿性木聚糖酶菌株為短小芽孢桿菌。1材料與方法1．

3、1材料樺木木聚糖購(gòu)于Sigma公司，其余生化試劑均為國(guó)產(chǎn)。1．2方法1．2．1菌株篩選參考文獻(xiàn)報(bào)道方法（14）取楊凌地?zé)崴畼悠?8O℃孵育30min，涂布于含1％木聚糖的固體培養(yǎng)基，45℃培養(yǎng)48h用0．1％剛果紅溶液染色1h，用1mol／LNaCI脫色1h。選取有透明圈的菌落保存?zhèn)溆谩?．2．2木聚糖酶活力的測(cè)定木聚糖酶活力采用DNS法測(cè)定（15）：準(zhǔn)確配制1mol／L木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別量取O、O．1、0．2、0．3、O．4、O．5mL木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10mL帶塞玻璃管中，用蒸餾水補(bǔ)齊至2mL，再加入2mLDNS試劑，沸水浴5min，流水冷卻，

4、加蒸餾水至10mL，反轉(zhuǎn)混勻。得到木糖的終濃度0，0．O1，O．O2，O．03，O．04，O．05mg／mL。在波長(zhǎng)540nm進(jìn)行比色。以光密度值為縱坐標(biāo)。木糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。發(fā)酵液經(jīng)8000g離心10min，得到的上清即為粗酶液。取O．2mL稀釋酶液到加塞玻璃管中，再加入1．8mL0．5％木聚糖溶液(0．5％木聚糖溶液由木聚糖、pH7．0的磷酸鹽緩沖液、蒸餾水以8：1：1的比例配制)，60℃反應(yīng)10min，快速加入2mLDNA試劑中止反應(yīng)，沸水浴5min，用蒸餾水定容至10mL，在540nm波長(zhǎng)下比色，讀數(shù)。0．2mL稀釋酶液、1

5、．8mL0．5％木聚糖溶液、2mLDNS試劑一起加入，沸水浴5min，蒸餾水定容至10mL，作為測(cè)試對(duì)照。酶活定義：每分鐘生成1umol木糖所需酶量為一個(gè)酶活單位（U）。1．2．3菌株鑒定產(chǎn)酶菌株采用革蘭氏染色，對(duì)其細(xì)胞形態(tài)、大小、產(chǎn)芽孢情況顯微鏡觀察。1．2．4最適反應(yīng)溫度和耐受性試驗(yàn)設(shè)置40℃，45℃，50℃，55℃，60℃,65℃和70℃的溫度條件，對(duì)粗酶液進(jìn)行測(cè)定。2結(jié)果與討論2．1菌種篩選采集地?zé)崴畼悠?，?O℃滅活營(yíng)養(yǎng)體后涂布于含木聚糖的固體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用剛果紅染色法篩選得到有透明圈的菌株。2．2最適反應(yīng)溫度將得到菌株在含木聚糖的

6、液體的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到粗酶液，在不同反應(yīng)溫度下測(cè)定木聚糖酶活性，試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1)，將粗酶液與木聚糖底物反應(yīng)在不同溫度反應(yīng)，60℃時(shí)活性最高，因此木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為60℃(最高酶活為69.97U/mL)。圖1木聚糖酶最適反應(yīng)溫度測(cè)定2．3溫度耐受性將木聚糖粗酶液在80℃進(jìn)行孵育后，在最適反應(yīng)溫度檢測(cè)木聚糖酶的活力。試驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，粗酶液在80℃孵育120min后，仍具有70％的活力，表明該酶有很好的熱耐受性。圖2熱耐受性檢測(cè)2．3菌種鑒定將篩選的菌株在固體LB平板上培養(yǎng)過夜，菌落為圓形、白色、不透明、邊緣不光滑。革蘭氏染色結(jié)果（

7、圖3）顯示為陽性菌，顯微鏡觀察菌體呈直桿狀，兩端稍圓，單個(gè)排列，有少量的端生芽孢。形態(tài)鑒定初步表明屬于革蘭氏陽性的芽孢桿菌。圖3革蘭氏染色相差觀察本試驗(yàn)從地?zé)崴蟹蛛x到1株產(chǎn)耐熱木聚糖酶的芽孢菌株。酶學(xué)試驗(yàn)表明該菌株產(chǎn)生的木聚糖酶最適反應(yīng)條件為60℃，孵育120min仍具有70％的活力，表明該酶具有較強(qiáng)的熱耐受性。該菌株具有較好的熱耐受潛力，為耐熱耐熱木聚糖酶的生產(chǎn)提供了基因資源。參考文獻(xiàn)：1．劉明啟，孫建義，許英蕾．木聚糖酶分子進(jìn)化的研究進(jìn)展[J]．中國(guó)生物工程雜志。2003，23(1O)：62-66．2．張紅蓮，姚斌，范云六．木聚糖酶的分子生物

8、學(xué)及其應(yīng)用[J]．生物技術(shù)通報(bào)，2002，(3)：23-30．3．SinghS，MadlalaAM，PriorBA．The