中國生物工程雜志 china biotechnology vol25 no9 2005

《中國生物工程雜志 china biotechnology vol25 no9 2005》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、中國生物工程雜志ChinaBiotechnology,2005,25(9):84~88長白山藥用真菌樹舌凝集素的純化及生化特性*張春玉黃國輝林景衛(wèi)孫非許守民劉立俠**（東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院長春130024）摘要用硫酸銨分級沉淀、離子交換和HPLC層析等方法，從長白山藥用真菌樹舌的菌絲體中分離純化了一種凝集素（Ganodermaapplanatumlectin，簡稱GAL），SDSPAGE檢測其為單一蛋白條帶。經(jīng)過SDS-PAGE測得其亞基分子量為15kDa左右，HPLC分析分子量為58kDa左右，表明GA

2、L由4個亞基組成。氨基酸組成分析表明，GAL中甘氨酸含量較高，不含蛋氨酸和色氨酸，中性糖含量約11.2%。圓二色CD譜顯示其含有3.6%的α螺旋、46.8%的β轉(zhuǎn)角和49.6%無規(guī)則卷曲，不含有β折疊。GAL可以凝集供試的2種動物血和3種血型人血的血紅細胞，但對不同來源的血紅細胞凝集滴度不同。糖抑制實驗表明，只有棉籽糖和D-松三糖部分抑制GAL的凝血活性。GAL具有較好的熱穩(wěn)定性且其凝血活性不受Ca2+、Mg2+和Zn2+等二價陽離子的影響。關(guān)鍵詞樹舌凝集素生化特性血凝集活性收稿日期：20050627修回日

3、期：20050805*國家留學(xué)青年資助基金(2003),吉林省科技廳重大招標(biāo)資助項目(200404013)**通訊作者，電子信箱：liulx062@nenu.edu.cn凝集素（Lectin）是一類廣泛存在于動植物和微生物中非免疫來源的蛋白質(zhì)或糖蛋白，它能與糖專一性地結(jié)合，具有凝集血細胞的作用［1］。目前全世界大約有50多種藥用真菌凝集素被純化，其分子量為12~190kDa，含糖量為0%~18％［2］，這些凝集素能夠參與和介導(dǎo)細胞中各種生命現(xiàn)象的調(diào)節(jié)，尤其是其顯著的抗腫瘤作用引起了人們的廣泛關(guān)注。研究表明

4、從靈芝（GanodermaCapense）、金針菇（Flammulinavelutipes）、楊樹菇（Agrocybeaegerita）和口蘑（Tricholomamongolicum）等真菌中分離的凝集素都具有很強的抗腫瘤活性［3~6］。由此可見，凝集素是藥用真菌的一種主要藥理成分。長白山區(qū)具有豐富的食用和藥用真菌資源，其特產(chǎn)的樹舌是具有較高藥用價值的大型真菌。本文報道了從長白山來源的樹舌菌絲體中分離出天然的凝集素成分，分析了其理化性質(zhì)、血凝集活性和特點，為藥用真菌樹舌中生物活性物質(zhì)的研究和利用提供依據(jù)。1材

5、料與方法1.1材料樹舌菌種購自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物所；小白鼠和家兔購自吉林省生物制品所實驗動物中心；正常人血由吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)研究所提供，收集的血配成2%的紅細胞懸液。DEAESephadexA25為Pharmacia產(chǎn)品；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、Tris和十二烷基磺酸鈉（SDS）等化學(xué)試劑購于上海生工生物技術(shù)有限公司；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為寶泰克產(chǎn)品；糖抑制實驗中所用的糖均為Sigma產(chǎn)品；實驗中所用其它試劑皆為國產(chǎn)分析純。1.2方法1.2.1凝集素的分離純化稱取液體培養(yǎng)的樹舌菌絲體60g（鮮重），加入10mmol

6、/LTrisHCl(pH8.0)置冰箱浸泡24h，經(jīng)高速搗碎機勻漿后，四層紗布過濾，濾液在3500r/min條件下離心20min，收集上清液，向其中加入固體硫酸銨達40％飽和度，低溫攪拌20min置4℃冰箱過夜。4000r/min條件下離心30min后棄沉淀，繼續(xù)向上清液中加入固體硫酸銨達90％飽和度，攪拌、放置、離心同前，最后獲取的沉淀透析脫鹽后得樹舌凝集素（GAL）粗品。取DEAESephadexA25經(jīng)處理后裝柱（2.6cm×40cm）用NaCl液平衡，取上述GAL粗提液（濃度為3mg/ml）上柱，流

7、速30ml/h，5ml/tube，0.1~1.6mol/LNaCl洗脫液4℃層析柜進行線性離子梯度洗脫，收集洗脫峰透析凍干后備用，并進行凝血活性檢測。1.2.2凝集素在HPLC上的純化和檢測將凍干后樣品用10mmol/LTris-HCl(pH8.0)溶解，經(jīng)HPLC純化，條件為：儀器：JapanSHIMADZULC-10AVP系統(tǒng)，檢測器：SHIMADZUSPD－10AVP，工作站：CLASS-Vp，色譜柱：TSK-GEL，G3000PWXL，SIL-10ADVP自動進樣器進樣，流動相0.9%NaCl（pH8.

8、0），流速0.5ml/min，柱溫為4℃，壓力為1.6mpa,取供試樣品（濃度為2mg/ml）1ml，045μm柱頭過濾器濾過，設(shè)定20μl進樣量,記錄色譜圖。將收集的蛋白峰和記錄峰對照進行凝血活性檢測，嚴(yán)格收集第1活性峰，透析除鹽，冷凍干燥后得GAL純品。2005,25(9)張春玉等：長白山藥用真菌樹舌凝集素的純化及生化特性中國生物工程雜志ChinaBiotechnologyVol.