中國生物工程雜志china biotechnology, 2005, 25(9)69～73 釀酒

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1、中國生物工程雜志ChinaBiotechnology,2005,25(9):69～73釀酒酵母工業(yè)菌株中XI木糖代謝途徑的建立*沈煜**王穎史文龍劉向勇鮑曉明***曲音波（山東大學微生物技術國家重點實驗室濟南250100）摘要根據(jù)代謝工程原理，采取多拷貝整合策略，利用整合載體pYMIKP，將來自嗜熱細菌Thermusthermophilus的木糖異構酶（XI）基因xylA和釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）自身的木酮糖激酶（XK）基因XKS1，插入釀酒酵母工業(yè)菌株NAN27的染色體中，得到工程菌株NAN

2、114。酶活測定結果顯示，NAN114中XI和XK的活性均高于出發(fā)菌株NAN27，表明外源蛋白在釀酒酵母工業(yè)菌株中得到活性表達。對木糖、葡萄糖共發(fā)酵搖瓶實驗結果表明，工程菌NAN114消耗木糖4.6g/L，產(chǎn)生乙醇6.9g/L，較出發(fā)菌株分別提高了43.8%和9.5%。首次在釀酒酵母工業(yè)菌株中建立了XI路徑的木糖代謝途徑。關鍵詞木糖釀酒酵母乙醇木糖異構酶木酮糖激酶收稿日期：20050315修回日期：20050614*國家自然科學基金委員會與中國節(jié)能投資公司聯(lián)合研究基金資助項目(50273019),國家重點基礎研究

3、發(fā)展計劃資助項目(2003BC716006、2004CB719702)**現(xiàn)工作單位：江南大學生物工程學院***通訊作者，電子信箱：bxm@sdu.edu.cn燃料乙醇是最有發(fā)展前景的環(huán)境友好新型能源。木質纖維素是年產(chǎn)量巨大且目前尚未被充分利用的可再生資源，其水解物中木糖的含量僅次于葡萄糖［1］。促進木糖向乙醇的生物轉化是充分利用木質纖維素生物質，降低乙醇生產(chǎn)成本的關鍵環(huán)節(jié)之一［2，3］。因此，利用代謝工程手段，拓展乙醇轉化的底物，對于木質纖維素資源全利用具有重要的理論意義和應用價值。釀酒酵母（Saccharomycescere

4、visiae）是傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)菌株，因缺乏將木糖轉化為木酮糖的代謝途徑而不能很好地利用木糖［1，3~5］。自然界中由木糖轉化為木酮糖的代謝途徑有兩條：其一，木糖經(jīng)依賴NADPH的木糖還原酶（xylosereductase，XR）還原形成木糖醇，再由依賴NAD+的木糖醇脫氫酶（xylitoldehydrogenase，XDH）催化形成木酮糖［4］。其二，木糖在木糖異構酶（xyloseisomerase，XI）的作用下直接轉化木糖形成木酮糖［5］。同時，代謝途徑下游的木酮糖激酶（xylulokinase）催化木酮糖磷酸化形成5磷酸

5、木酮糖的酶促反應也是木糖代謝的限速步驟之一［6，7］。由于XR和XDH催化反應需要的輔酶不同，因而在木糖代謝過程中造成氧化還原不平衡，直接導致副產(chǎn)物木糖醇的大量積累［4］。木糖異構酶可以直接轉化木糖到木酮糖，不需要輔酶，被認為是構建代謝木糖釀酒酵母工程菌株的便利途徑，但許多不同種屬來源的木糖異構酶在釀酒酵母中均沒有得到活性表達［5］，直到1996年Walfridsson等［5］首次在釀酒酵母中實現(xiàn)了嗜熱細菌Thermusthermophilus木糖異構酶的活性表達。但是，Walfridsson等［5］采用的是附加體載體系統(tǒng)，以單

6、倍體營養(yǎng)缺陷基因型的實驗室菌株作為受體菌，外源基因在重組菌株中的表達穩(wěn)性較差，不具備產(chǎn)業(yè)化意義。對工業(yè)生產(chǎn)菌株的代謝工程改造是工程菌產(chǎn)業(yè)化的前提條件，釀酒酵母生產(chǎn)菌株多倍性及野生基因型的狀態(tài)，不能適用常規(guī)的分子生物學操作體系［8］。本文在建立了釀酒酵母工業(yè)菌株轉化體系的基礎上，以釀酒酵母酒精生產(chǎn)工業(yè)菌株NAN27為出發(fā)菌株，通過本實驗室構建的整合載體pYMIKP，將T.thermophilus的木糖異構酶基因xylA以及同源木酮糖激酶基因XKS1，整合于NAN27染色體中，并對工程菌株木糖葡萄糖共發(fā)酵進行了初步研究。1材料與

7、方法1.1菌株和質粒EscherichiacoliDH5α（F-recA1endA1hsdR17［rK-mK-］supE44λ-thi-1gyrA96relA1）用于亞克隆。質粒pBXI［9］，用于克隆基因xylA的模板。釀酒酵母酒精生產(chǎn)工業(yè)菌株S.cerevisiaeNAN27（由河南天冠企業(yè)集團惠贈）為出發(fā)菌。pMAxy203為本實驗室構建，攜帶在磷酸甘油激酶啟動子終止子（PGKp.t）控制下的XKS1基因［9］，用于克隆PGKXKS1片段的模板。質粒pYMIKP為本實驗室構建的酵母整合表達載體［10］，其選擇標記為G

8、418抗性基因（Kanr），同時帶有釀酒酵母的2.2kbrDNA片段，作為多拷貝整合位點。1.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件E.coli在LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)，添加50mg/ml氨芐青霉素用以篩選轉化子。S.cerevisiae在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)于30℃。在含有G41