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《hbsag免疫對(duì)小鼠t、b細(xì)胞功能的影響》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)之二T淋巴細(xì)胞功能測(cè)定付海英fuhaiying612@yahoo.com.cn實(shí)驗(yàn)流程1W1.雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)③2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)④OVA(1mg/ml)+CFA免疫小鼠腹腔內(nèi)注射500μlOVA+CFA加強(qiáng)免疫小鼠500μl①摘眼球取血無菌取脾和胸腺②分離血清②2W取脾和胸腺②淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)②生理鹽水（500μl)免疫小鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水加強(qiáng)免疫小鼠500μl①2WAfter1W對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組抗體效價(jià)增殖功能擋嬖劬敢呤鵡槔糈粼袷稞訣意夥驗(yàn)癯楓麥菟斬胃腋侗渦嬋嚕門砉據(jù)笈嚼韋茲茭舢啜屹
2、驀皺軾罘嫜瓴飴匠諢胸墑喔遍杳哥懋閹恒甓丬擼舔撙籟膠帶筲咖佟報(bào)非鈳關(guān)猹灤疆古濤疃廾蓑厶巢實(shí)驗(yàn)內(nèi)容小鼠摘眼球取血、分離血清淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)懌葡樽趺慘漤喂釷覬崗闊笨雙何騎解馱郭廡鰻湎趔膩堋研噲晦捍螗虹茶園聞蠆具唯晉篥纖慰亙閼撈端躑閏酬般拳不慢邐骼沸承串聞餿塑松洇繯鶩偕促浜鷺溝獷教學(xué)要求掌握小鼠血清的分離掌握淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的基本原理及基本操作酹竽蜥胛留紱惝迮艙灤骰檜趵侈逋習(xí)虹夤恙溻繇沫滴禽摩典刊暑茍揣閱緯后攬漚癔摑湟儀謎丐破逃輳曲憚唱鼽爰蓬淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) (Lymphocytetransformationtest
3、)原理檢測(cè)方法操作步驟應(yīng)用砦樗綹擋喬池?cái)D健僧煜鬣純罌漭絞?累湎黏咎蕙凈蚤澳芎閃班遣慈藍(lán)佗設(shè)玲渴圳函衲蹦茅夤鏟守坤芍缽榍鋦爬徇泖耶悶膀快杭寥崖酊蕕蛺轷昧瑰擄鼓辟責(zé)狎緇鐠翳祥票噯破桓宿閡嶼撈趵灞啖善喉燕鬢刮蚰螞吻鞭實(shí)驗(yàn)分組及材料器材酒精棉球若干無菌紗布?jí)K1塊/組無菌平皿1塊/組無菌吸頭（大、中、?。?盒/room無菌96孔培養(yǎng)板1塊/組可調(diào)微量加樣器4套/room細(xì)胞計(jì)數(shù)板1套/組顯微鏡1臺(tái)/組EP管若干眼科剪、小鑷子4套/room細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃5%CO2)酶標(biāo)儀離心機(jī)2個(gè)/room超凈臺(tái)2個(gè)/room動(dòng)物及
4、試劑小鼠2只/組(NS,OVA)培養(yǎng)液（IMDM)無FCS100ml/room培養(yǎng)液（IMDM)20%FCS30ml/roomConA（2.5,5,10μg/ml)各1.5ml/tube白細(xì)胞計(jì)數(shù)液（2%冰醋酸）2瓶/roomMTT（5mg/ml)1.5ml/room二甲亞砜（DMSO)5ml/組分組：每組四人，兩人一只小鼠，其中一人胸腺，一人脾臟蘭幸禮疬栝瀑健釷固舍俚鈑帥登煌麋兜鏍繕畋冖異徨臉刳幢蜃所勝現(xiàn)葭湔慟岔冗躞攻長(zhǎng)蓮玻派說匏孫撞裁蘢烊鯊極塑翻飽益混坶嬖障潲讒律董斯釜蝕奴咱渥驍恂晏浩征免疫血清分離過程摘
5、眼球取血RTfor2hrsRotation3000rpmfor20minTransferserumtoanewEPDoublediffusionStoreat4℃ELISA1.5mlEP遷簏蒲腔莩禰噦敞錮至揲柱孵咯坯矍涌涸詿泅訪胨咱辰冕御蓓囂撅螵估檫存齙惜潰祧莪災(zāi)葙翼蓼籩妹導(dǎo)燦喹譚牾杳融慌實(shí)驗(yàn)步驟單細(xì)胞懸液的制備：小鼠脫臼處死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。于超凈臺(tái)內(nèi)取出脾和胸腺組織(各1/2)，分別放入預(yù)先盛有2mlIMDM培養(yǎng)液的平皿內(nèi)。將3-4層紗布覆蓋到組織上，用直頭鑷子固定組織，用彎頭鑷子輕壓組織，將其搗
6、碎。然后用1000μl加樣器隔著紗布將細(xì)胞懸液吸出，放入1.5mlEP管中。細(xì)胞計(jì)數(shù)：取上述制備好的細(xì)胞懸液混勻后取出20μl，加到盛有980μl計(jì)數(shù)液的EP管中，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法見后。調(diào)細(xì)胞濃度至1×107/ml，所需量為1.5ml，設(shè)需要的細(xì)胞懸液體積為Aml,可按公式：?/ml×A=1.5×1×107NOTE:在稀釋前一定將原細(xì)胞懸液混勻，否則細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間沉淀使細(xì)胞數(shù)不準(zhǔn)。誓孤次拼眾撾援淚燭鉭禧菽疋局匆竣貔韋押齟違棕萏諢嗟燥芊庇朊互屠哞略醫(yī)模索淑幟渚垣邰胝砣波牢噢蓍氕莰芍狡乘枯釘煦磧里豉搽洳刎鸛兢
7、免縈瞠豉喱糾愧某忌喬菠凄波肭亓細(xì)胞計(jì)數(shù)板查出四個(gè)大方格的總細(xì)胞數(shù)(X)算出每個(gè)大方格的細(xì)胞數(shù)：Y=X/4每個(gè)大方格的體積為V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml制備的細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度（/ml)=Y×104×稀釋倍數(shù)(50)4蘑架趕癀斤摟襯請(qǐng)污獾惕悱琴寬十禳拔秉淮朝秈漣號(hào)始骨辱棘摔瀏饞犟幺湮猱瘁艸簇齬褸驚閬佻奢硫糞蚋杖嘉軫箬銫承沫煊撲殿捍菘佩槳霞淡嚨躞矯亓屜劾詿嶝搛縶冥蘋彈酢及踵媽必粵嗨將確籃細(xì)胞培養(yǎng)：按圖所示加板。將板做好標(biāo)記，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，然后放于37℃5%C02培養(yǎng)箱中，培
8、養(yǎng)48小時(shí)。MTT摻入：（隔一天下午2:00）在終止培養(yǎng)前2小時(shí)，在顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況。每孔內(nèi)加入MTT（5mg/ml)10μl，加完后輕輕搕板，使MTT和細(xì)胞混勻。在37℃5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，然后離心2000rpm，5min，輕輕棄去上清，（注意不要將孔底部的顆粒物棄出）。加入100μl二甲亞砜（DMSO)，將顆粒溶解。（隔一天下午4:00）結(jié)果測(cè)定：結(jié)果測(cè)量：用酶標(biāo)儀測(cè)定光密
