抗纖軟肝顆粒對(duì)肝星狀細(xì)胞整合素介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路的影響

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1、湖北中醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文抗纖軟肝顆粒對(duì)肝星狀細(xì)胞整合素介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路的影響姓名：劉林申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：中醫(yī)內(nèi)科學(xué)指導(dǎo)教師：張赤志20070519原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含其他任何個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的作品或成果。對(duì)本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。論文作者簽名：日期：年月日學(xué)位論文使用授權(quán)說(shuō)明本人完全了解湖北中醫(yī)學(xué)院關(guān)于收集、保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：按照學(xué)校要求提交學(xué)位論文的印刷本；學(xué)校有

2、權(quán)保存學(xué)位論文的印刷本；在不以贏利為目的的前提下，學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的部分或全部?jī)?nèi)容。(保密論文在解密后，遵守此規(guī)定)論文作者簽名：導(dǎo)師簽名；同期：年月同湖北中醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文中文摘要目的肝纖維化(1iverfibrosis，LF)為各種慢性肝疾患所導(dǎo)致的一系列損傷—修復(fù)，最終肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ExtracellularMatrix，ECM)過(guò)度沉積的反應(yīng)。由于發(fā)生的機(jī)制比較復(fù)雜，至今對(duì)肝纖維化的了解還很有限，因此制約了肝纖維化治療的發(fā)展。肝星狀細(xì)胞(HepaticStellateeell，HSC)作為ECM的主要生成細(xì)胞，被認(rèn)為是各種肝臟損傷引起肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。

3、在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中，對(duì)肝星狀細(xì)胞激活的啟動(dòng)、維持，細(xì)胞外基質(zhì)也起著重要的作用。HSC與ECM之間存在著復(fù)雜的相互作用，而其相互作用主要經(jīng)整合素介導(dǎo)。黏著斑激酶(focaladhesionkinase，F(xiàn)AK)是整合素信號(hào)途徑中連接整合素與下游信號(hào)分子的媒介，是胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)途徑的交匯點(diǎn)。其中，以FAK為中心的整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要是Ras-ldAPK途徑，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1／2(extracellulaksignal—regulatedkinase，ERKl／2)是MAPK家族中研究最為清楚的成員，其通路Ras-RAF--MEK—ERK參與細(xì)胞多種活動(dòng)。抗纖軟肝顆粒

4、組方在臨床上有良好的療《效，現(xiàn)將其制成適應(yīng)臨床需要的顆粒劑。在既往研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，從肝星狀細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用著手，以整合素、FA[、ERKl／2為研究切入點(diǎn)，研究抗纖軟肝顆粒對(duì)肝星狀細(xì)胞整合素信號(hào)通路的影響，由此闡釋抗纖軟肝顆粒抗肝星狀細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制。方法：(1)首先根據(jù)處方中丹參、莪術(shù)及鱉甲所含化學(xué)成分的理化性質(zhì)及其藥瑤作用，以提取丹參酮IIA和莪術(shù)揮發(fā)油為目的，確定抗纖軟肝顆粒的制備制成工藝，用正交設(shè)計(jì)的直觀分析優(yōu)化幾種輔料的用量確定最終的制劑處方。(2)考察成品的體外溶出度；同時(shí)對(duì)之進(jìn)行全面的質(zhì)量控制研究，制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。(3)

5、運(yùn)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以HSC-T6細(xì)胞系為研究對(duì)象，分為空白包被+10％生理鹽水血清組、FN包被+10％生理鹽水血清組、FN包被：1-5％kxr組、FN包被+10％kxr組，F(xiàn)N包被+20％kxr組。按以上分組進(jìn)行藥物干預(yù)，各組FN(3pg／m1)均于kxr加入前30分鐘加入，干預(yù)后繼續(xù)培養(yǎng)48h．(4)采用MTT法測(cè)細(xì)胞增殖，采用甲苯胺藍(lán)染色方法測(cè)定細(xì)胞黏附率；Annexinv-PB／7一ADD法測(cè)定Hsc凋亡。(5)應(yīng)用免疫細(xì)胞組織化學(xué)方法檢測(cè)HSC整合素0【5D1蛋白的表達(dá)。(6)應(yīng)用免疫細(xì)胞組織化學(xué)方法檢測(cè)HSCFAK蛋白的表達(dá)，采用RT-PCR法測(cè)定FAKmRN

6、A的表達(dá)。(7)應(yīng)用免疫細(xì)胞組織化學(xué)方法檢測(cè)HSCERKl蛋白的表達(dá)，湖北中醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文采用RT-PCR法測(cè)定ERKlmRNA的表達(dá)。結(jié)果：(1)丹參的滲漉最佳工藝為：用90％的乙醇進(jìn)行滲漉，流速為0．6ml／min，乙醇用量為12倍，浸泡時(shí)間為16h；鱉甲超微粉碎后置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)粒徑小于5um的多于50％，粒徑小于10um的多于90％；莪術(shù)揮發(fā)油的最佳提取工藝為加水8倍，浸泡時(shí)間為0．5h，煎煮5h。莪術(shù)揮發(fā)油的最佳包合工藝為揮發(fā)油：D—cD(1：4)，攪拌時(shí)間為60min，包合溫度為50U，以10000r／min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行包合。制備工藝中確定以糊精為輔料，藥

7、物：糊精：1：0．5，以50％乙醇為潤(rùn)濕劑，加入0．4％倍CMC作為助懸劑，過(guò)16目篩制粒，50"C干燥，10目篩整粒。(2)含量測(cè)定方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn)中，其回收率合格，精密度，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，說(shuō)明了所制定的含量測(cè)定方法的合理性和可行性；樣品在考察期各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯變化，均符合規(guī)定。(3)與FN組比較，kxr各組均可以抑制HSC增殖，存在顯著差異(P<0．01)，kxr各組均可以誘導(dǎo)HSC凋亡，與Flq組及空白對(duì)照組比較存在顯著差異(P