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1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文利用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建dsRNA原核表達(dá)體系抗煙草花葉病毒的研究姓名：尹國(guó)華申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：溫孚江20090505利用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建dsRNA原核表達(dá)體系抗煙草花葉病毒的研究3，擴(kuò)增TMVCP基因，分別對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和L4440質(zhì)粒進(jìn)行幾，I和Sail雙酶切，構(gòu)建LCP480載體；設(shè)計(jì)引物TMVCPI．5和TMVCPI．3、TMVCPII-5和耵州CPII．3、GUSII．5和GUSII．3，構(gòu)建pGEM．CP480載體；設(shè)計(jì)引物CPI．5和CPI．3、CPII．5和CPII．3、GUSI．5
2、和GUSI．3，構(gòu)建pET．CP480載體。(3)原核表達(dá)體系的構(gòu)建：將構(gòu)建成功的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入構(gòu)建的RNaseIII突變體和HTll5菌株中，獲得原核表達(dá)體系。將構(gòu)建好的原核表達(dá)體系，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，均可提取長(zhǎng)度約為660bp或者480bp的dsRNA，表明所構(gòu)建的RNaseIII缺失體和HTl15菌株具有相同特性，均可以用于dsRNA的誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)不同的原核表達(dá)體系表達(dá)的dsRNA進(jìn)行熒光定量PCR分析，結(jié)果表明：M．JMl09或者M(jìn)．JMl09lacY菌株dsRNA的表達(dá)量明顯高于其他菌株，載體pGEM．CP480為適宜生產(chǎn)dsRNA的表
3、達(dá)載體，因此M．JMl09／pGEM．CP480或者M(jìn)．JMl091acY／pGEM．CP480為最優(yōu)化的原核表達(dá)體系，其相對(duì)表達(dá)量分別為6．50+O．69和7．28±o．56。(4)抗病性檢測(cè)：對(duì)來源于不同原核表達(dá)載體表達(dá)的dsRNA進(jìn)行抗病性鑒定，結(jié)果表明，來源于不同原核表達(dá)載體表達(dá)的dsRNA抗病效果基本一致，都能達(dá)到50％左右的抗病率，說明不同的表達(dá)載體生產(chǎn)的dsRNA對(duì)TMV的防治并沒有區(qū)別。抗病植株的Northernblot分析表明，抗病植株能夠產(chǎn)生siRNA，而野生型對(duì)照植株則檢測(cè)不到siRNA，外源的dsRNA能夠防治植物病毒的侵染，這
4、種抗病性為RNA介導(dǎo)的抗病性。2、原核表達(dá)TMV不同功能基因dsRNA介導(dǎo)的抗病性比較研究(1)n州不同功能基因dsRNA表達(dá)載體的構(gòu)建：Trizol法提取TMV總RNA，設(shè)計(jì)引物TMVRP．5和TMVRP．3，MMP．5和TMVMP．3，TMVRNA．5和TMVRNA．3，采用RT．PCR技術(shù)分別克隆了TMV復(fù)制酶基因、運(yùn)動(dòng)蛋白基因和54kDaRNA聚合酶基因的部分序列，采用PCR技術(shù)亞克隆三個(gè)基因480bp片段，反向重復(fù)插入pGEM．GUS載體，構(gòu)建三個(gè)不同基因的dsRNA表達(dá)載體，分別為pGEM．RP480、pGEM．MP480和pGEM．RNA
5、480。將構(gòu)建好的dsRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)入HTl15菌株中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，均可表達(dá)480bp的dsRNA，證明所構(gòu)建的dsRNA表達(dá)載體正確。(2)TMV不同功能基因dsRNA介導(dǎo)的抗病性比較：用原核表達(dá)的TMV復(fù)制酶基因、運(yùn)動(dòng)蛋白基因、54kDaRNA聚合酶基因和衣殼蛋白基因的dsRNA處理煙草植株，進(jìn)行抗病性鑒定。初步的檢測(cè)結(jié)果表明，原核表達(dá)刪不同功能基因的dsRNA2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文均能保護(hù)植物抵抗TMV病毒的侵染，但介導(dǎo)的抗病性存在著差異。其中來源于運(yùn)動(dòng)蛋白基因的dsRNA介導(dǎo)的抗病效果最好，66％左右的處理植株表現(xiàn)為抗?。粊碓从谝職さ?/p>
6、白基因的dsRNA介導(dǎo)的抗病效果較好，48％的處理植株表現(xiàn)為抗??；而來源于54kDaRNA聚合酶基因和復(fù)制酶基因的dsRNA介導(dǎo)的抗病效果較差，表現(xiàn)為抗病的處理植株的比例分別為40％和34％。關(guān)鍵詞：Red重組系統(tǒng)，RNA介導(dǎo)的抗病性，RNaseIll，dsRNA，TMV利用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建dsRNA原核表達(dá)體系抗煙草花葉病毒的研究ConstructionofadsRNAprokaryoticexpressionsystemusingRedrecombinationforresistancetoTobaccoMosaicVirusAbstractRe
7、combinantDNAtechnologyoffersaneffectivewaytoobtainvirusresistantplants．ThistechnologyisoftennamedasanRNA—mediatedvirusresistance．TheessenceofRNA-mediatedvirusresistanceisposttranscriptionalgenesilencing(PTGS)，alsoknownasRNAinterference(RNAi)．Compared塒tllotherbiotechnologicalappr
8、oachesinantiviraltransgenicengineering，RMVRishi
