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1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文多環(huán)芳烴菲對(duì)微生物生態(tài)毒理研究、菲降解菌的分離鑒定及降解基因克隆與表達(dá)姓名：夏穎申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：閔航20040501多環(huán)芳烴菲對(duì)微生物生態(tài)毒理研究、菲降解菌的分離鑒定及降解基因克隆與表達(dá)中文摘要多環(huán)芳烴(Polycyclicaromatichydrocarbon，隊(duì)Hs)在環(huán)境中分布廣泛，極易在環(huán)境中累積并可通過食物鏈傳遞，對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境具有很大危害性。菲囡具有獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，成為隊(duì)Hs研究中的模式化合物，菲污染的研究不僅有利于污染環(huán)境中菲的去除，還可為其它PAHs污
2、染的防治提供有價(jià)值的資料。本文全面探討了菲污染對(duì)淹水稻田土壤的微生物生態(tài)毒性效應(yīng)并分離到兩株菲降解細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行了鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育研究，同時(shí)進(jìn)行了降解特性和降解基因克隆及表達(dá)方面的研究，為建立有效的菲污染預(yù)警指標(biāo)體系和菲降解微生物的有效利用提供有益的參考。本研究所獲主要結(jié)論如下：l、以杭州臨平鎮(zhèn)附近農(nóng)田水稻土為材料，采用室內(nèi)培養(yǎng)方法系統(tǒng)研究了不同程度的菲污染對(duì)淹水稻田土壤可培養(yǎng)微生物種群以及酶活性動(dòng)態(tài)變化過程的影響。研究結(jié)果表明，不同濃度的菲對(duì)好氧細(xì)菌的生長(zhǎng)和脲酶都具有刺激作用。并且刺激作用隨菲濃度的升高而有所加強(qiáng)；不
3、同濃度的菲對(duì)真菌和脫氫酶則在整個(gè)培養(yǎng)過程中都具有毒性作用，特別在高濃度菲處理土樣中，這一表現(xiàn)更為明顯；各濃度的菲都對(duì)放線菌、厭氧固氮菌和產(chǎn)甲烷細(xì)菌具有急性毒性效應(yīng)，并且100mg，l(g干土的濃度一直表現(xiàn)出對(duì)放線菌的毒性效應(yīng)。在傳統(tǒng)微生物污染生態(tài)研究基礎(chǔ)上，運(yùn)用PcR．DGGE方法，對(duì)菲污染條件下稻田土壤真細(xì)菌種群的基因多樣性進(jìn)行了初步研究。通過對(duì)菲處理后的淹水稻田土壤的DOGE圖譜和多樣性指數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)各處理間的土壤微生物多樣性出現(xiàn)了一定的差異，并且菲濃度越高與對(duì)照土樣的多樣性指數(shù)相似性越低。2、從石油污染土壤中篩選
4、分離到2株菲降解菌株，分別命名為zx4和E、，A17菌株。通過細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察，生理生化測(cè)試，碳源利用實(shí)驗(yàn)(Bjolog)，G+Cm01％含量分析，全細(xì)胞脂肪酸分析以及16srDNA和ITs序列同源性分析，證明兩株菲降解細(xì)菌應(yīng)屬于鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌。其中菌株zx4被鑒定為少動(dòng)鞘氨醇單胞菌的又一菌株，推測(cè)菌株E、A17應(yīng)當(dāng)?shù)谝徽虑把缘谝还?jié)多環(huán)芳烴菲的微生物降解綜述1．多環(huán)芳烴的累積和環(huán)境毒性多環(huán)芳烴(PolycycIicaromatichydrocarbon，PAHs)是由兩個(gè)或兩個(gè)以上的苯環(huán)以線形排列、彎接或簇聚的方式而
5、構(gòu)成。隊(duì)Hs在環(huán)境中分布廣泛，由于其自身的疏水性及低水溶性，能很快進(jìn)入到沉積環(huán)境中。并且它們隨著苯環(huán)數(shù)量增加，脂溶性越強(qiáng)，水溶性越低，在環(huán)境中存在的時(shí)間越長(zhǎng)，遺傳毒性越高。PAHs極易在環(huán)境中累積并可通過食物鏈傳遞，對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境具有很大危害性(莫測(cè)輝等，2002；蔡全英等，2002：s∞ed甜口，．，1995；Paterson甜口l，1990；Bell甜口正，199l；Xliste＆Alexander，1991)。美國(guó)環(huán)保局早在上一世紀(jì)80年代初便把16種未帶分支的PAHs確定為環(huán)境中的優(yōu)先污染物(Yan甜口f
6、，2004)(圖1+1)，我國(guó)也早把PAHs列入環(huán)境優(yōu)先監(jiān)測(cè)的污染物黑名單。：oo：N-曲lⅫ●時(shí)：$：：昂：：嘏：《冷?融：：國(guó)：：搗：：豳：：國(guó)：：鼢。鶿?圖卜116種優(yōu)先處理的多環(huán)芳烴的結(jié)構(gòu)和名稱FjgI·lSt兀lcturesandnomenclaturesof16PAHsinEPAprioritypolIutantllst螄～妒。绱一越一粵磐璺澎第一章前言1．1PAHs的理化和毒性特征天然環(huán)境中的PAHs按其物化性質(zhì)可分為兩類：一類為帶有2—3個(gè)苯環(huán)的低分子量的芳香烴．如萘、菲和葸等，這些化合物易揮發(fā)，對(duì)生物
7、有一定的毒性；第二類為帶有4~7個(gè)苯環(huán)的高分子量芳烴，如芘、熒葸、苯并(a)芘，等，這些化合物沸點(diǎn)高，不易揮發(fā)，遺傳毒性較高(岳敏等，2003)。PAHs進(jìn)入生物體內(nèi)，首先會(huì)被細(xì)胞色素P450依賴性的混合功能氧化酶(MFO)代謝，某些隊(duì)Hs經(jīng)細(xì)胞微粒體中的混合功能氧化酶激活后會(huì)轉(zhuǎn)化為致癌物，它們通過在蛋白質(zhì)的酮一烯醇互變異構(gòu)過程中起催化作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞蛋白質(zhì)分子的不可逆轉(zhuǎn)變，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的癌變。如苯并(a)芘代謝與肺癌具有一定的相關(guān)性，焦化廠工人肺癌死亡率明顯高于其周圍居民。研究表明，大氣中苯并(a)芘濃度每增加百萬(wàn)
8、分之一，其污染地面的肺癌死亡率可上升5％。此外，在PAHs的代謝過程中往往伴隨著大量自由基的產(chǎn)生。自由基具有很強(qiáng)的親電性，極易與各種生物大分子結(jié)合，導(dǎo)致酶失活、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化、DNA斷鏈、脂質(zhì)過氧化等一系列氧化損傷。并進(jìn)一步引起細(xì)胞組織器官的病理變化(劉玲．1987；傅娟齡，1989)。而且由于PAHs化學(xué)結(jié)構(gòu)的特性，它能穩(wěn)定地吸
