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1、蝎毒多肽提取物對白血病小鼠E-鈣黏蛋白、CD49d和CXCR4表達(dá)的影響作者：楊文華,呂俊秀,楊向東史哲新,高宏湯毅于文俊郝征【摘要】 目的探討蝎毒多肽提取物（PESV）對E-鈣黏蛋白、CD49d和CXCR4表達(dá)的影響，探究PESV對白血病細(xì)胞髓外浸潤的影響與機制。方法NOD-SCID小鼠50只，建立人白血病NOD-SCID小鼠髓外浸潤模型，隨機分為5組，每組10只，分別為PESV高、中、低劑量組，模型組和空白組。PESV高、中、低劑量組小鼠分別尾靜脈注射PESV1.2，0.6，0.3mg/kg,模型組和空白組均注射0.9%的生理鹽水0.3ml，治療28d后，用流
2、式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血中CD49d和CXCR4的表達(dá)，35d處死小鼠后用免疫組化法檢測其肝臟中E-鈣黏蛋白表達(dá)。結(jié)果治療組CD49d和CXCR4的表達(dá)均低于模型組（P＜0.01），各治療組E-鈣黏蛋白表達(dá)均高于模型組（P＜0.01）。結(jié)論PESV可以有效地提高白血病小鼠E-鈣黏蛋白的表達(dá)，降低CD49d和CXCR4的表達(dá)，具有較好的阻抑白血病細(xì)胞髓外浸潤的作用。【關(guān)鍵詞】蝎毒多肽提取物 白血病 E-鈣黏蛋白 CD49d CXCR411惡性腫瘤的浸潤過程包括：組織浸潤、淋巴管滲透、血管滲透、漿膜及黏膜蔓延等，其轉(zhuǎn)移過程與黏附因子密切相關(guān)。而白血病的浸潤為白血病細(xì)胞首先
3、從骨髓中逸出到外周血液，而后受到趨化作用進(jìn)而黏附到血管內(nèi)皮上并產(chǎn)生遷移、降解細(xì)胞外基質(zhì)，繼而在髓外組織生存、增殖最后形成浸潤灶，以上過程受到多種因子調(diào)控，其中黏附因子的關(guān)系最為密切［1，2］。本實驗旨在運用流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化研究PESV對白血病小鼠黏附因子CD49d、CXCR4和E-鈣黏蛋白表達(dá)的影響，探討PESV阻止細(xì)胞黏附的效應(yīng)靶點,為將其運用于臨床防治白血病髓外浸潤提供可靠的理論依據(jù)。 1材料與儀器 1.1小鼠及分組SPF級的健康NOD-SCID雌鼠50只，3～4周齡，體質(zhì)量18～20g，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所，隨機分為5組，每組10只，即空白
4、對照組，模型組，PESV高劑量組，PESV中劑量組，PESV低劑量組。各組實驗前均在137cs源環(huán)境下照射270cGy，除空白對照組外，其余各組均在照射后24h靜脈或腹腔注射濃度2×107個人的骨髓單個核細(xì)胞［3］。注射單個核細(xì)胞后第2天，腹腔注射G-CSF0.3ml/只，連續(xù)7d。停用G-CSF后，蝎毒多肽高劑量組、蝎毒多肽中劑量組、蝎毒多肽低劑量組分別腹腔注射高（1.2mg/kg）、中（0.6mg/kg）、低（0.3mg/kg）劑量的蝎毒多肽提取物，空白組給予等量的0.9%生理鹽水，在SPF條件下飼養(yǎng)28d后開始進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。2811d后高、中、低劑量治療組
5、小鼠分別存活9只，7只，7只，模型組存活6只，空白對照組存活10只?！ ?.2藥物取蝎毒凍干粉溶解(1g/40ml,pH7.4)，低溫離心，5000r/min，30min；0.45μm和0.22μm微孔濾膜過濾，將超濾物凍干。取蝎毒凍干粉400mg加磷酸緩沖液上樣，經(jīng)葡萄糖凝膠，收集蝎毒Ⅲ-Ⅳ蛋白峰，再進(jìn)行陽離子交換層析，對該部位用高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography,HPLC)儀進(jìn)行檢測，收集PESV蛋白峰，臨用時PESV用生理鹽水溶解稀釋成各濃度。 1.3試劑和儀器 1.3.1流式檢測熒光素標(biāo)記羊抗小鼠IgG/
6、FITC（由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供），未標(biāo)記的抗小鼠的CXCR4抗體（由eBioscience公司提供），F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗小鼠CD49b抗體，A液（甲酸 1.2ml/l,天津中醫(yī)藥大學(xué)中心實驗室提供），流式細(xì)胞儀(FACS420型)為美國BD公司產(chǎn)品。 1.3.2免疫組化顯微鏡（麥克奧迪BA400），成像系統(tǒng)（MoticImagesAdvanced3.2），恒溫培養(yǎng)箱（黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司SKP-02.600），微波爐（格蘭仕WD800S），二甲苯，無水乙醇（北京化工廠產(chǎn)品），第一抗體（武漢博士德BA047511E-Cadherin），生物素標(biāo)記的
7、第二抗體（生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG，北京鼎國），辣根過氧化酶標(biāo)記鏈親和素溶液（1∶1000倍稀釋，北京鼎國，HD009-1），DAB工作液（北京鼎國，DDAB-002），過氧化物酶阻斷劑（北京鼎國），蘇木素復(fù)染液（北京鼎國）?！ ?方法 2.1外周血中CD49d表達(dá)的檢測取100μl外周血加入流式管底部，加入0.5μlFITC標(biāo)記的CD49b抗體，渦旋使其與外周血混勻，避光孵育30min，加A液，用流式細(xì)胞儀檢測?！ ?.2外周血中CXCR4表達(dá)的檢測取40μl外周血加入流式管底部，加入1μl（1mg/ml）的未標(biāo)記的抗小鼠的CXCR4抗體，渦旋使其與外周血混
