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《HPLC色譜條件的優(yōu)化與色譜》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、HPLC色譜條件的優(yōu)化 與色譜技術(shù)進(jìn)展一、分離度方程式動力學(xué)熱力學(xué)Rs=1/4N·K/(K＋1)·(α－1)/α柱效保留時間選擇性混合物中不同組分在兩相間平衡分配性質(zhì)的差異是色譜分離的基礎(chǔ)，研究物質(zhì)平衡分配的內(nèi)容屬于色譜熱力學(xué)的范疇。容量因子K決定了組分的保留時間，而分離因子α決定了組分的分離選擇性。這二個重要的色譜參數(shù)都取決于溶質(zhì)、固定相和流動相的熱力學(xué)性質(zhì)。在溶質(zhì)、固定相和流動相的某種組合下，只要不同組分的平衡分配性質(zhì)存在差異，而且這種差異又足夠大時，就有可能實(shí)現(xiàn)分離。要使分離的可能性變?yōu)榭尚?，則必須設(shè)法控制色譜過程中使色譜峰發(fā)生展寬的各種外在因素。色譜峰的展寬主要決定于柱
2、填料的性質(zhì)以及填裝質(zhì)量，例如填料顆粒大小、粒徑分布、形狀、表面積、孔徑、孔體積，等等。研究柱效與各種影響因素的關(guān)系是色譜動力學(xué)的內(nèi)容。1、Rs分離度a）Rs=2（tR2-tR1）/（W2+W1）或1.18（tR2-tR1）/（W2,h/2+W1,h/2）b）Rs＜0.8不符合分析化學(xué)要求Rs=1二峰重疊2%Rs＞1.2二峰完全分離2、K容量因子a）K=（tR-tO）/tob）K對分離度的影響Rsαk/（K+1）一般K取2-10，以2-4最好。c）改變K的方法改變流動相的溶劑強(qiáng)度（常以溶劑的溶解度參數(shù)或極性參數(shù)表示）。常用溶劑的溶解度參數(shù)δ（25℃）溶劑δ溶劑δ正己烷7.3二氧六
3、環(huán)9.8乙醚7.4丙醇10.2三乙胺7.5乙醇11.2環(huán)己烷8.2二甲基甲酰胺11.5醋酸乙酯8.6乙腈11.8三氯甲烷9.1醋酸12.4四氫呋喃9.1甲醇12.9苯9.2甲酰胺17.9二氯甲烷9.6水21對于大多數(shù)溶劑，極性參數(shù)（p）與溶解度參數(shù)（δ）基本呈平行關(guān)系?；旌先軇┑娜軇?qiáng)度按體積比取加權(quán)平均值。溶劑強(qiáng)度2個單位的變化一般可引起容量因子10倍的變化。3、N理論塔板數(shù)a）N=16（tR/W）2或5.54（tR/Wh/2）2b）N對分離度的影響RsαNc）提高柱效的方法●增加柱長●改進(jìn)柱填料（純度、物理性狀）●提高填裝質(zhì)量4、α分離因子a）α=K2/K1=t＇R2/t＇
4、R1b）α對分離度的影響Rsα（α-1）/α影響敏感，α的微小變化可顯著改變Rsc）改變α的方法在保持流動相極性基本不變的前提下，適當(dāng)改變流動相的組成、組分的比例或添加調(diào)節(jié)劑。5、N與α對Rs貢獻(xiàn)的比較二、VanDeemtor方程h=A·F1/3+B/F+Cm·F+Cs·F=A·F1/3+C·F式中h=1/N理論塔板高度F=流動相流速Cm，Cs=溶質(zhì)在流動相和固定相中的濃度B=縱向擴(kuò)散的貢獻(xiàn)因子（縱向濃度梯度）A=渦流擴(kuò)散的貢獻(xiàn)因子（色譜柱的不均勻性）溶質(zhì)在液體中的擴(kuò)散系數(shù)比氣體中小4—5個數(shù)量級，所以在HPLC中在通常的流速條件下B項(xiàng)的貢獻(xiàn)可忽略不計(jì)。1、柱效與流速的關(guān)系存在
5、最佳流速2、柱效與填料粒徑的關(guān)系a）A=2λ·dp式中2λ為與填充均勻性有關(guān)的因數(shù)dp為填料的粒徑b）小的dp有利于傳質(zhì)c）減小填料粒徑可顯著提高柱效由上表可見，減小dp可顯著提高柱效→縮短恒壓色譜柱→增加流速↓↓縮短洗脫時間三、影響分離效果的其他因素1、溫度柱溫提高到40℃以上，謂之HTLC（40℃—200℃）●溫度上升→流動相粘度下降→流速增加（≤8ml/min）→容量因子K下降→保留時間縮短●粘度降低→柱壓下降→可采用細(xì)粒徑填料（＜3um）或長色譜柱→提高柱效●提高靈敏度色譜峰高與柱溫呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系，即峰高的對數(shù)與柱溫呈線性關(guān)系峰高隨柱溫呈指數(shù)增加時，靈敏度也呈指數(shù)增加，
6、數(shù)據(jù)表明，柱溫從30℃上升至90℃，定量限約可降低10倍?！窀纳七x擇性不同溶質(zhì)的保留時間隨柱溫變化的程度不盡相同，有可能使原來未分離的成分的得到基線分離，甚至發(fā)生洗脫順序逆轉(zhuǎn)。這種溫度使選擇性改變的特性在混合物的分離中非常有用，因?yàn)樗恍韬唵蔚馗淖冎鶞?，而無需改變其他色譜條件?！駵囟绕ヅ淞鲃酉囗氼A(yù)熱至柱溫，溫度匹配可以使柱效提高50%以上。柱后應(yīng)配冷卻單元，使洗脫液溫度快速降到一固定值（如35℃），以避免檢測信號的波動?！裆V柱以硅膠為基質(zhì)的填料，其使用溫度一般不超過60℃；HTLC使用以氧化鋯、多孔石墨碳、高分子微球?yàn)榛|(zhì)的填料或采用多配位基有機(jī)硅膠為填料。2、pH引入次級化
7、學(xué)平衡（電離、絡(luò)合、離子對等）改變?nèi)苜|(zhì)的濃度或存在形式，用以提高選擇性。3、柱外效應(yīng)UPLC的技術(shù)要求V池＜0.1V柱（2—5ul）V管路＜0.1V柱（0.1mm,id）V進(jìn)樣＜0.15V峰（2—5ul）tC＜0.1tR（10—15S，自動進(jìn)樣器）V死＜0.3ml死體積的影響●延遲出峰時間●減低柱效●使梯度曲線變形四、UPLC（UFLC）的評估1、優(yōu)勢：●柱效高●運(yùn)行時間短●適用于高通量篩選●便于與MS聯(lián)用2、短處：●高柱壓降（泵，摩擦生熱導(dǎo)致柱效下降和選擇性變化）●色譜成分殘留●進(jìn)樣器交叉
