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1、HPLC色譜柱選擇與維護(hù)保養(yǎng)Sa安捷倫科技安捷倫HPLC色譜柱選擇分離模式的選擇樣品溶于有機(jī)溶劑溶于水溶于四氫呋喃非離子化離子化溶于有機(jī)溶劑溶于水溶于正己烷溶于甲醇或甲醇/水或乙腈或乙腈/水用硅膠的正相模式用鍵合相的正相模式用鍵合相的反相模式用鍵合相的反相模式低分子凝膠滲透色譜用鍵合相的反相模式抑制電離反相鍵合相色譜離子對(duì)鍵合相的反相模式用硅膠的正相模式離子交換模式凝膠滲透色譜凝膠過濾色譜大孔填料的離子交換模式用大孔填料的反相模式分子量>2,000分子量<2,000反相分配色譜極性:固定相<流動(dòng)相固定相-非極性流動(dòng)相(甲,乙醇,乙腈,THF,二氯乙烷)-極性非極性物質(zhì)后出
2、峰正相吸附色譜極性:固定相>流動(dòng)相固定相-極性流動(dòng)相(己烷,庚烷)-非極性極性物質(zhì)后出峰正相色譜20%反相色譜80%正相&反相色譜硅膠基質(zhì)-pH3~8Al2O3.nH2O-pH1~14聚合物基質(zhì)-pH1~14高或低pH下,硅膠會(huì)溶解化學(xué)修飾困難孔結(jié)構(gòu)復(fù)雜,孔徑不均勻?qū)е轮Р粔蚋?有機(jī)溶劑可能導(dǎo)致聚合物基質(zhì)溶漲而受損柱填料基質(zhì)C-18柱---性能影響因素鍵合類型碳覆蓋率封端化學(xué)性質(zhì)物理性質(zhì)硅膠純度色譜柱尺寸顆粒形狀粒徑表面積孔徑硅膠純度?填料硅膠的純度與殘留金屬離子濃度色譜柱尺寸?填料床的長(zhǎng)度和內(nèi)徑顆粒形狀?球型或不規(guī)則型粒徑?平均顆粒直徑,通常3-10μm表面積?顆粒外
3、表面和內(nèi)部孔表面的總和,以m2/gram表示孔徑?顆粒的孔或腔的平均尺寸,范圍80-300?色譜柱物理性質(zhì)C-18柱---性能影響因素鍵合類型?單體鍵合-鍵合相分子與基體單點(diǎn)相連?聚合體鍵合-鍵合相分子與基體多點(diǎn)相連碳覆蓋率?與基體物質(zhì)相連的鍵合相的量封端?鍵合步驟之后,用短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來色譜柱化學(xué)性質(zhì)C-18柱---性能影響因素A類硅膠OriginalZORBAXSIL(1970s)由于帶負(fù)電荷的殘留硅羥基和酸性表面上金屬含量高(硅羥基的pKa低),導(dǎo)致堿性化合物發(fā)生拖尾B類硅膠(高純)ZORBAXRx-Sil(1987)由于金屬含量低,硅羥基pKa高,
4、堿性化合物不發(fā)生拖尾ZorbaxRx-SIL:11種金屬<35ppm(未檢出其他雜質(zhì),<1ppm);99.995%純度的二氧化硅C-18柱---性能影響因素ZORBAX?生產(chǎn)工藝硅膠+脲(pH=2)+甲醛CH2O孔徑80A&300ADO2250oC粒徑1.8μm3.5μm5.0μm7.0μm微球表面的略微融合專利技術(shù)增強(qiáng)了硅膠填料的耐流動(dòng)相沖刷能力---Zorbax色譜柱使用壽命長(zhǎng)的技術(shù)保障安捷倫擁有此項(xiàng)溶膠-凝膠填料專利技術(shù)StableBondEclipseXDBBonus-RPExtendZORBAXRx多孔硅膠微球色譜柱尺寸---對(duì)色譜分離的影響?短柱(15-100
5、mm)-運(yùn)行時(shí)間短,柱壓低?長(zhǎng)柱(150-250mm)-分辨率高,運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)?窄徑柱(?2.1mm)-檢測(cè)器靈敏度高?寬徑柱(3-21.2mm)-載樣量高C-18柱---性能影響因素顆粒形狀---對(duì)色譜分離的影響當(dāng)使用黏度較大的流動(dòng)相50:50=MeOH:H2O時(shí),球型顆粒可以降低柱壓,延長(zhǎng)色譜柱壽命C-18柱---性能影響因素球形不規(guī)則形粒徑---對(duì)色譜分離的影響較小的顆粒柱效較高,但會(huì)引起柱壓過高.3.5μm粒徑的常用于分離復(fù)雜的多組份樣品,而組份單一的樣品多采用5μm的粒徑1.8μm3.5μm5μm7μm10μm表面積---對(duì)色譜分離的影響高表面積對(duì)于多組份樣品的分
6、離具有較強(qiáng)的保留能力,柱容量和分離度.表面積低的填料通常能迅速達(dá)到平衡狀態(tài),對(duì)于梯度淋洗尤為重要C-18柱---性能影響因素孔徑---對(duì)色譜分離的影響大孔的填料顆粒可以延長(zhǎng)溶質(zhì)大分子在填料表面滯留的時(shí)間,達(dá)到充分分離,改善峰形樣品MW?4,000,選擇80?的孔徑樣品MW>4,000,選擇300?的孔徑大孔徑填料適用于大分子分析大孔徑300?全多孔色譜柱可用于分離蛋白質(zhì)和多肽分子量雖小但hydrodynamicvolume(水動(dòng)力學(xué)體積)較大的分子Poroshell色譜柱高流速下,高柱效分析大分子的蛋白質(zhì)和多肽色譜柱填料孔徑必須適合待測(cè)物分子自由進(jìn)出填料孔,與孔內(nèi)表面的鍵
7、合相進(jìn)行分離分配300?孔徑可改善蛋白質(zhì)和多肽峰形0.2000.020.040.060.080.100.120.140.160.18300SB-C18(300?)SB-C18(80?)PW1/2LeuEnkephalinM.W.=556AngiotensinII(血管緊張素II)M.W.=1046InsulinBM.W.=3,496CytCM.W.=12,327Rnase(核糖核酸酶)M.W.=13,684Lysozyme(溶菌酶)M.W.=13,900孔徑,分子量對(duì)峰寬的影響(梯度分離)選擇合適的填料孔徑分析大分子可獲得最佳
