人胚胎干細(xì)胞無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系的建立

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1、學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得直昌太堂或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名(手寫)：橢簽字日期：勘哆年易月占日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解南昌大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印

2、件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)南昌大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編本學(xué)位論文。同時(shí)授權(quán)中國(guó)科學(xué)技術(shù)信息研究所和中國(guó)學(xué)術(shù)期刊(光盤版)電子雜志社將本學(xué)位論文收錄到《中國(guó)學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)》和《中國(guó)優(yōu)秀博碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)》中全文發(fā)表，并通過網(wǎng)絡(luò)向社會(huì)公眾提供信息服務(wù)。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)傘學(xué)位論文作者簽名(手寫)：噙私敦導(dǎo)師簽名(手寫)：習(xí)砭1簽字日期：加【、年('月易日簽字日期：加哆年易月眵日摘要目

3、的：擬建立一種人胚胎干細(xì)胞無飼養(yǎng)層無血清的培養(yǎng)體系，使其能維持人胚胎干細(xì)胞未分化的增殖狀態(tài)及全能性，為人胚胎干細(xì)胞進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究及將來的臨床應(yīng)用提供有益的探索。方法：在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和常用的Knockout培養(yǎng)基共同支持下，擴(kuò)增人胚胎干細(xì)胞X．01，Ⅳ型膠原酶消化傳代培養(yǎng)?；|(zhì)膠鋪底后，將人胚胎干細(xì)胞分別置于常用的Knockout培養(yǎng)基(1組)、自制無血清培養(yǎng)基(2組)和添]I]bFGF及肝素的改良無血清培養(yǎng)基(3組)中進(jìn)行培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)10代后觀察比較三組培養(yǎng)條件下人胚胎干細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、克

4、隆數(shù)目及大小情況。同時(shí)借助細(xì)胞免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)和體外擬胚體形成等方法檢測(cè)人胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)和全能性。結(jié)果：1、細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯示：常用Knockout培養(yǎng)組(第1組)條件下，hESCsX．01細(xì)胞具有典型的人胚胎干細(xì)胞特征形態(tài)，克隆大，飽滿，形似鳥巢，細(xì)胞間緊密堆積，細(xì)胞核大，胞核與胞漿的比例高；自制無血清培養(yǎng)組(第2組)：hESCsX．01克隆呈扁平橢圓形，體積稍小，欠飽滿，細(xì)胞間較松散，傳代3次后逐漸呈分化狀，不能連續(xù)傳代；改良無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)組(第3組)：克隆形態(tài)與第1組相似，克隆

5、大，飽滿，克隆內(nèi)細(xì)胞排列緊密，核大，核質(zhì)比高。2、單位視野下hESCsX．01細(xì)胞克隆個(gè)數(shù)及大小的比較結(jié)果顯示：常用Knockout培養(yǎng)組(第1組)hESCsX．01細(xì)胞單位視野內(nèi)克隆個(gè)數(shù)為(5．9±1．O)個(gè)，自制無血清培養(yǎng)組(第2組)為(5．04-0．8)個(gè)，改良無血清培養(yǎng)組(第3組)為(6．6+0．7)個(gè)，第1組與第3組間克隆個(gè)數(shù)無差異(P>O．05)，而第2組克隆個(gè)數(shù)明顯少于第1組和第3組(尸

6、6)％，第2組為(41．94-7．6)％，第3組為(55．6±7．9)％，同樣第1組與第3組間克隆體積大小無明顯差異(P>0．05)，而第2組克隆體積顯著小于第1組和第3組(尸<0．05)。Il摘要3、免疫熒光染色結(jié)果示：hESCs均表達(dá)特異性多潛能標(biāo)志物Nanog、Oct．4、Tra．1．60和SSEA．4等，而不表達(dá)SSEA．1。本研究顯示常用Knockout培養(yǎng)組(第1組)和改良無血清培養(yǎng)組(第3組)hESCsX．01細(xì)胞均表達(dá)上述特異性多潛能標(biāo)志物(Nanog、Oct．4、Tra-1．60和

7、SSEA．4)，而不表達(dá)SSEA．1；而自制無血清培養(yǎng)組(第2組)中上述指標(biāo)均弱陽(yáng)性或陰性。4、三組培養(yǎng)條件下分別行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，結(jié)果顯示常用Knockout培養(yǎng)組(第1組)和改良無血清培養(yǎng)組(第3組)hESCsX．01細(xì)胞高表達(dá)特異性表面標(biāo)志物SSEA．4(表達(dá)率分別為84．53％、86．73％)，低表達(dá)SSEA．1(表達(dá)率分別為6．84％、7．34％)；而自制無血清培養(yǎng)組(第2組)hESCsX．01細(xì)胞較低表達(dá)特異性表面標(biāo)志物SSEA．4(表達(dá)率為55．82％)，較高表達(dá)SSEA．1(表達(dá)率為

8、39．43％)。5、擬胚體形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：常用Knockout培養(yǎng)組(第1組)和改良無血清培養(yǎng)組(第3組)條件下培養(yǎng)的llESCsX．0l細(xì)胞，在MEF培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，7d后能體外分化形成囊狀擬胚體，而自制無血清培養(yǎng)組(第2組)hESCsX．01細(xì)胞逐漸呈分化狀，不能持續(xù)傳代，不能形成擬胚體。結(jié)論：本研究通過添加bFGF和肝素來改良本實(shí)驗(yàn)室已獲得國(guó)家專利的無血清培養(yǎng)基，初步建立了一種人胚胎干細(xì)胞無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系，能維持人胚胎干細(xì)胞未分化增殖狀態(tài)及全能性，與常