人胚胎干細胞無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系的建立

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1、學位論文獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得直昌太堂或其他教育機構(gòu)的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學位論文作者簽名(手寫)：橢簽字日期：勘哆年易月占日學位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學位論文作者完全了解南昌大學有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復印

2、件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)南昌大學可以將學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編本學位論文。同時授權(quán)中國科學技術(shù)信息研究所和中國學術(shù)期刊(光盤版)電子雜志社將本學位論文收錄到《中國學位論文全文數(shù)據(jù)庫》和《中國優(yōu)秀博碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫》中全文發(fā)表，并通過網(wǎng)絡向社會公眾提供信息服務。(保密的學位論文在解密后適用本授權(quán)書)傘學位論文作者簽名(手寫)：噙私敦導師簽名(手寫)：習砭1簽字日期：加【、年('月易日簽字日期：加哆年易月眵日摘要目

3、的：擬建立一種人胚胎干細胞無飼養(yǎng)層無血清的培養(yǎng)體系，使其能維持人胚胎干細胞未分化的增殖狀態(tài)及全能性，為人胚胎干細胞進一步的基礎(chǔ)研究及將來的臨床應用提供有益的探索。方法：在小鼠胚胎成纖維細胞和常用的Knockout培養(yǎng)基共同支持下，擴增人胚胎干細胞X．01，Ⅳ型膠原酶消化傳代培養(yǎng)?；|(zhì)膠鋪底后，將人胚胎干細胞分別置于常用的Knockout培養(yǎng)基(1組)、自制無血清培養(yǎng)基(2組)和添]I]bFGF及肝素的改良無血清培養(yǎng)基(3組)中進行培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)10代后觀察比較三組培養(yǎng)條件下人胚胎干細胞形態(tài)學變化、克

4、隆數(shù)目及大小情況。同時借助細胞免疫熒光染色、流式細胞術(shù)和體外擬胚體形成等方法檢測人胚胎干細胞的未分化狀態(tài)和全能性。結(jié)果：1、細胞形態(tài)學顯示：常用Knockout培養(yǎng)組(第1組)條件下，hESCsX．01細胞具有典型的人胚胎干細胞特征形態(tài)，克隆大，飽滿，形似鳥巢，細胞間緊密堆積，細胞核大，胞核與胞漿的比例高；自制無血清培養(yǎng)組(第2組)：hESCsX．01克隆呈扁平橢圓形，體積稍小，欠飽滿，細胞間較松散，傳代3次后逐漸呈分化狀，不能連續(xù)傳代；改良無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)組(第3組)：克隆形態(tài)與第1組相似，克隆

5、大，飽滿，克隆內(nèi)細胞排列緊密，核大，核質(zhì)比高。2、單位視野下hESCsX．01細胞克隆個數(shù)及大小的比較結(jié)果顯示：常用Knockout培養(yǎng)組(第1組)hESCsX．01細胞單位視野內(nèi)克隆個數(shù)為(5．9±1．O)個，自制無血清培養(yǎng)組(第2組)為(5．04-0．8)個，改良無血清培養(yǎng)組(第3組)為(6．6+0．7)個，第1組與第3組間克隆個數(shù)無差異(P>O．05)，而第2組克隆個數(shù)明顯少于第1組和第3組(尸

6、6)％，第2組為(41．94-7．6)％，第3組為(55．6±7．9)％，同樣第1組與第3組間克隆體積大小無明顯差異(P>0．05)，而第2組克隆體積顯著小于第1組和第3組(尸<0．05)。Il摘要3、免疫熒光染色結(jié)果示：hESCs均表達特異性多潛能標志物Nanog、Oct．4、Tra．1．60和SSEA．4等，而不表達SSEA．1。本研究顯示常用Knockout培養(yǎng)組(第1組)和改良無血清培養(yǎng)組(第3組)hESCsX．01細胞均表達上述特異性多潛能標志物(Nanog、Oct．4、Tra-1．60和

7、SSEA．4)，而不表達SSEA．1；而自制無血清培養(yǎng)組(第2組)中上述指標均弱陽性或陰性。4、三組培養(yǎng)條件下分別行流式細胞術(shù)檢測，結(jié)果顯示常用Knockout培養(yǎng)組(第1組)和改良無血清培養(yǎng)組(第3組)hESCsX．01細胞高表達特異性表面標志物SSEA．4(表達率分別為84．53％、86．73％)，低表達SSEA．1(表達率分別為6．84％、7．34％)；而自制無血清培養(yǎng)組(第2組)hESCsX．01細胞較低表達特異性表面標志物SSEA．4(表達率為55．82％)，較高表達SSEA．1(表達率為

8、39．43％)。5、擬胚體形成實驗結(jié)果顯示：常用Knockout培養(yǎng)組(第1組)和改良無血清培養(yǎng)組(第3組)條件下培養(yǎng)的llESCsX．0l細胞，在MEF培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，7d后能體外分化形成囊狀擬胚體，而自制無血清培養(yǎng)組(第2組)hESCsX．01細胞逐漸呈分化狀，不能持續(xù)傳代，不能形成擬胚體。結(jié)論：本研究通過添加bFGF和肝素來改良本實驗室已獲得國家專利的無血清培養(yǎng)基，初步建立了一種人胚胎干細胞無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系，能維持人胚胎干細胞未分化增殖狀態(tài)及全能性，與常