《核酸的分離純化》PPT課件

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1、第五章核酸的分離純化溫州醫(yī)學(xué)院彭穎DNA和RNA是生物體中最重要的核酸分子，是分子生物學(xué)和分子診斷的研究對象DNA和RNA的分離純化是分子生物學(xué)研究及分子診斷最基礎(chǔ)的工作第五章核酸的分離純化核酸分離純化的原則:保持核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性盡可能提高核酸制品的純度第五章核酸的分離純化第一節(jié)核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則第二節(jié)基因組DNA的分離純化第三節(jié)質(zhì)粒DNA的提取與純化第四節(jié)RNA的分離純化第五章核酸的分離純化第一節(jié)核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則一、材料與方法的選擇二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)三、核酸的鑒定與保存第一節(jié)核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則一、材料與方法的選擇（一）材料與方法的選擇（二）選擇原

2、則（一）材料與方法的選擇不同的研究目的對核酸的完整性、純度、產(chǎn)量及濃度有不同的要求。需考慮制備核酸所需的時(shí)間與成本應(yīng)選擇安全的試劑與制備方案一、材料與方法的選擇1.保持核酸堿基序列的完整性2.盡量清除其它分子的污染，保證核酸純度3.保持核酸的完整性盡量簡化分離純化步驟，縮短提取時(shí)間盡量避免各種有害因素對核酸的破壞（二）選擇原則一、材料與方法的選擇二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)（一）核酸的釋放（二）核酸的分離與純化（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌（一）核酸的釋放DNA和RNA均位于細(xì)胞內(nèi)（病毒除外），因此核酸分離與純化的第一步即是裂解細(xì)胞、釋放核酸。二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)應(yīng)該清除的雜質(zhì)主要包括

3、:1.非核酸的大分子污染物蛋白質(zhì)、多糖及脂類物質(zhì)等2.非需要的核酸分子分離某一核酸分子時(shí)，其它核酸皆為雜質(zhì)3.加入的有機(jī)溶劑和某些金屬離子（二）核酸的分離與純化二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀是濃縮核酸最常用的方法常用的鹽類:醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、氯化鉀及氯化鎂常用的有機(jī)溶劑:乙醇、異丙醇和聚乙二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的鹽，需用70%～75%的乙醇洗滌去除二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)三、核酸的鑒定與保存（一）核酸的鑒定（二）核酸的保存（一）核酸的鑒定1.濃度鑒定2.純度鑒定3.完整性鑒定三、核酸的鑒定與保存紫外分光光度法：核酸分子中的堿基具有共軛雙

4、鍵結(jié)構(gòu)，可以吸收紫外線，其最大吸收波長為260nm。1.濃度鑒定三、核酸的鑒定與保存各種堿基的紫外吸收光譜三、核酸的鑒定與保存熒光光度法：核酸的熒光染料溴化乙錠嵌入堿基平面后，本身無熒光的核酸在UV激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。熒光強(qiáng)度的積分與溶液中核酸的含量呈正比。三、核酸的鑒定與保存EB與DNA的結(jié)合三、核酸的鑒定與保存紫外分光光度法：主要通過A260與A280的比值來判定有無蛋白質(zhì)的污染。比值升高或降低均提示制備的核酸純度不佳。2.純度鑒定三、核酸的鑒定與保存1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/

5、ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0三、核酸的鑒定與保存熒光光度法：EB等熒光染料示蹤的核酸電泳可判定核酸制品的純度。三、核酸的鑒定與保存瓊脂糖凝膠電泳：以EB為示蹤劑的核酸凝膠電泳可判定核酸制品的完整性基因組DNA如果發(fā)生降解，電泳圖呈拖尾狀3.完整性鑒定三、核酸的鑒定與保存DNA的降解三、核酸的鑒定與保存完整的或降解很少的總RNA電泳圖譜中，三條帶熒光強(qiáng)度應(yīng)呈特定的比值。沉降系數(shù)大，電泳遷移率低，熒光強(qiáng)度高沉降系數(shù)小，電泳遷移率高，熒光強(qiáng)度低三、核酸的鑒定與保存28S（或23S）RNA的

6、熒光強(qiáng)度一般約為18S（或16S）RNA的2倍，否則提示有RNA的降解若在點(diǎn)樣孔附近有著色條帶，提示可能存在DNA的污染三、核酸的鑒定與保存三、核酸的鑒定與保存（二）核酸的保存1.DNA的儲(chǔ)存2.RNA的儲(chǔ)存三、核酸的鑒定與保存溶于TE緩沖液中的DNA在-70℃冰箱可保存數(shù)年。TE的pH為8.0時(shí)，DNA的脫氨反應(yīng)減少，pH低7.0時(shí)DNA易變性。1.DNA的保存（二）核酸的保存三、核酸的鑒定與保存2.RNA的保存三、核酸的鑒定與保存RNA溶于H2O或0.3mol/L的NaAc溶液中，-70℃保存RNA溶液中加入RNasin或VRC，可延長保存時(shí)間用于配置試劑及溶解RNA

7、的H2O均應(yīng)經(jīng)DEPC處理第二節(jié)真核基因組DNA的分離純化生物體組織細(xì)胞玻棒纏繞法酚抽提法基因組DNA粗品PFGE分離特定的DNA片段AGE分離PAGE分離乙醇沉淀洗滌基因組DNA純品精分離粗分離前處理離子交換層析純化有機(jī)溶劑抽提細(xì)胞裂解蛋白質(zhì)變性沉淀降解DNA釋放甲酰胺解聚法哺乳動(dòng)物基因組DNA分離純化的一般技術(shù)路線第二節(jié)真核基因組DNA的分離純化第二節(jié)真核基因組DNA的分離純化一、酚抽提法二、甲酰胺解聚法三、玻棒纏繞法四、其它方法五、DNA片段的純化六、DNA片段的回收一、酚抽提法1976年由Stafford及其同事創(chuàng)立，