《核酸分離純化》ppt課件

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1、第五章核酸的分離純化核酸的結(jié)構(gòu)與功能是分子水平生命活動的基礎(chǔ)；內(nèi)源基因的突變、表達(dá)及調(diào)控的異常和外源致病基因的侵入是人類疾病發(fā)生、發(fā)展的根源。第五章核酸的分離純化DNA、RNA是生物體中最重要的核酸分子，是分子生物學(xué)和分子診斷的研究對象。DNA、RNA的分離純化是分子生物學(xué)研究及對疾病進(jìn)行分子診斷的最基礎(chǔ)工作。第五章核酸的分離純化核酸分離純化的原則一、保持核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性二、盡可能提高核酸制品的純度第五章核酸的分離純化提取DNA總的原則1保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；2其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；3核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作

2、用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；4其他核酸分子，如RNA，也應(yīng)盡量去除。第一節(jié)核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則第二節(jié)基因組DNA的分離純化第三節(jié)質(zhì)粒DNA的提取與純化第四節(jié)RNA的分離純化第五章核酸的分離純化第一節(jié)核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則一、材料與方法的選擇二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)三、核酸的鑒定與保存第一節(jié)核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則一、材料與方法的選擇（一）材料與方法的選擇（二）選擇原則（一）材料與方法的選擇不同的研究目的對核酸的完整性、純度、產(chǎn)量及濃度可能有不同的要求需考慮制備核酸所需的時間與成本應(yīng)選擇安全的試劑與制備方案一、材料與方法的選擇1、保持核酸堿基序列的完整性2、

3、盡量清除其它分子的污染，保證核酸純度3、保持核酸的完整性應(yīng)盡量簡化分離純化步驟，縮短提取時間盡量避免各種有害因素對核酸的破壞（二）選擇原則一、材料與方法的選擇二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)（一）核酸的釋放（二）核酸的分離與純化（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌（一）核酸的釋放DNA和RNA均位于細(xì)胞內(nèi)（病毒除外），因此核酸分離與純化的第一步即是裂解細(xì)胞、釋放核酸。二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)表５-１各種組織細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法應(yīng)用Ⅰ機(jī)械法1勻漿法機(jī)體軟組織2搗碎法動物韌性組織3研磨法細(xì)菌、酵母Ⅱ物理法1超聲法細(xì)胞混懸液2反復(fù)凍融法培養(yǎng)細(xì)胞3冷熱交替法細(xì)菌、病毒4低滲裂解紅細(xì)胞Ⅲ化學(xué)法1

4、有機(jī)溶劑細(xì)菌、酵母2去垢劑組織、培養(yǎng)細(xì)胞3酶解法細(xì)菌、酵母核酸分子抽提的技術(shù)設(shè)計(jì)核酸的釋放：破裂細(xì)胞釋放核酸機(jī)械法與非機(jī)械法（非機(jī)械法中溶胞法是應(yīng)用最廣泛的方法）核酸的分離與純化：將含有核酸分子復(fù)雜復(fù)合物中，將核酸與其他物質(zhì)分離非核酸的大分子污染物（蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子）、非需要的核酸分子、試劑和溶液應(yīng)該清除的雜質(zhì)主要包括三部分1、非核酸的大分子污染物：蛋白質(zhì)、多糖及脂類物質(zhì)等2、非需要的核酸分子：分離某一特定的核酸分子時，其它的核酸分子皆為雜質(zhì)3、加入的有機(jī)溶劑和某些金屬離子（二）核酸的分離與純化二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀是濃縮核酸的

5、最常用的方法常用的鹽類有醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、氯化鉀及氯化鎂常用的有機(jī)溶劑則為乙醇、異丙醇和聚乙二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的鹽，需用70%～75%的乙醇洗滌去除二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)三、核酸的鑒定與保存（一）核酸的鑒定（二）核酸的保存（一）核酸的鑒定1、濃度鑒定2、純度鑒定3、完整性鑒定三、核酸的鑒定與保存⑴紫外分光光度法：該法是基于核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)因而可以吸收紫外線，其最大吸收波長為260nm。1、濃度鑒定三、核酸的鑒定與保存各種堿基的紫外吸收光譜三、核酸的鑒定與保存⑵熒光光度法：核酸的熒光染料溴化乙錠嵌入堿基平面后，本身無熒光的核酸

6、在UV激發(fā)下發(fā)出紅色熒光，且熒光強(qiáng)度的積分與溶液中核酸的含量呈正比。三、核酸的鑒定與保存EB與DNA的結(jié)合⑴紫外分光光度法：該法主要通過A260與A280的比值來判定有無蛋白質(zhì)的污染，比值升高與降低均提示不純。在TE緩沖液中，純DNA的A260/A280為1.8純RNA的A260/A280比值為2.02、純度鑒定三、核酸的鑒定與保存1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.

7、0三、核酸的鑒定與保存濃度鑒定紫外分光光度法：測定DNA在A260nm的光吸收值。如計(jì)算DNA濃度A260×稀釋倍數(shù)×50＝μg/ml紫外分光光度法只用于測定濃度大于0.25ug/ml的核酸溶液。(A值等于1時，相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA，40μg/ml單鏈DNA或RNA，20μg/ml單鏈寡核苷酸）⑵熒光光度法：用EB等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果可判定核酸制品的純度。DNA分子較RNA大得多，電泳遷移率低。三、核酸的鑒定與保存熒光光度法熒光染料溴化乙錠，可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強(qiáng)度與核酸含量呈正比。適用于低濃度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）

8、⑴瓊脂糖凝膠電泳法：以E