核酸分離純化

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1、第二節(jié)核酸的分離純化主要內(nèi)容前言1核酸分離、純化原則1.1保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性1.2.防止核酸的生物降解2分離提取核酸的主要步驟2.1細(xì)胞的破碎2.2核蛋白的解聚、變性蛋白的去除2.3核酸的沉淀2.4核酸的濃度測(cè)定2.5核酸的保存核酸（nucleicacid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。無論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對(duì)核酸進(jìn)行分離和純化。核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。前言Home1核酸分離、純化原則1.1保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性1.1.1意義：遺傳信息全部儲(chǔ)存在一級(jí)結(jié)構(gòu)之中，核酸的—級(jí)結(jié)構(gòu)

2、還決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。1.1.2分離核酸原則：1）溫度不要過高；2）控制pH值范圍(pH值5-9);3）保持一定離子強(qiáng)度;4）減少物理因素對(duì)核酸的機(jī)械剪切力.Home1.2防止核酸的生物降解細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)。所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。1.2.1DNA酶抑制劑(1）金屬離子螯合劑：DNA酶需要金屬二價(jià)離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價(jià)離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)、

3、8-羥基喹啉；(2）陰離于型表面活性劑：如SDS，該試劑除對(duì)核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液中沉淀。1.2.2RNA酶（RNAase)抑制劑RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。(1)皂土（bentonite）作用機(jī)制：皂土帶負(fù)電荷，能吸附RNase，使其失活。(2)DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液體，很強(qiáng)的核酸酶抑制劑。作用機(jī)制：與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。使用注意：1）DEPC也能破壞單鏈核酸中大部

4、分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大100～1000倍。2）容易降解，保存在4℃或液氮中；3）提RNA時(shí)，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。4）劇毒。（3)肝素（4）復(fù)合硅酸鹽（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧釩核糖核苷復(fù)合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)Home(1)高速組織搗碎機(jī)搗碎(2)玻璃勻漿器勻漿(3)超聲波處理法(4)液氮研磨法(5)化學(xué)處理法(SDS、LDS，吐溫80等）(6)生化法（溶菌酶、纖維素酶等）Home2.1細(xì)胞的破碎2.2核蛋

5、白的解聚、變性蛋白的去除核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負(fù)靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結(jié)合)、氫鍵和非極性的范德華力。分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時(shí)避免核酸降解。2.2.1加入濃鹽溶液（如NaCl）核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；2.2.2加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能；2.2.3酚/氯仿抽提酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對(duì)核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有機(jī)相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時(shí)氯仿具有去除植物色

6、素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液時(shí)，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機(jī)相的分離，再加上一定量的異戊醇（酚：氯：異戊醉=25：24：1）。(1）使用注意酚通常是透明無色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檠趸锟善茐暮怂岬牧姿岫ユI。(2）安全操作酚腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重的灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套。使用酚時(shí)應(yīng)注意Home2.3核酸的沉淀沉淀是濃縮核酸最常用的方法。優(yōu)點(diǎn)：①改變核酸的溶解緩沖液；②重新調(diào)整核酸的濃度；③去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。2.3

7、.1核酸沉淀的鹽類及濃度鹽貯存液濃度（mol/L)終濃度(mol/L)MgCl210.01NaAc3(pH5.2)0.3KAc3(pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.8當(dāng)核酸溶液的pH值大于4時(shí)，核酸分子呈多聚陰離子狀態(tài)，它與1價(jià)或2價(jià)陽離子形成的鹽在許多有機(jī)溶劑中不溶解，也不會(huì)被有機(jī)溶課劑變性。2.3.2有機(jī)沉淀劑（1）乙醇優(yōu)點(diǎn)：對(duì)鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)：需要量大，一般要求低溫操作。（2）異丙醇優(yōu)點(diǎn)：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般

8、不需低溫長時(shí)間放置。缺點(diǎn)：易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀．異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用70％乙醇漂洗數(shù)次。（3）聚乙二醇（PEG）優(yōu)點(diǎn)：可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段。應(yīng)用6000相對(duì)分子質(zhì)量的PEG進(jìn)行DNA沉淀時(shí)，使