核酸分離純化及電泳

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1、基因工程原理Introductiontogeneticengineerins一、基因工程的定義：在體外對(duì)不同生物的遺傳物質(zhì)（基因）進(jìn)行剪切、重組、連接，然后插入到載體分子中（細(xì)菌質(zhì)粒、病毒或噬菌體DNA)，轉(zhuǎn)入微生物、植物或動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無性繁殖，并表達(dá)出基因產(chǎn)物。二、基因工程誕生的理論基礎(chǔ)1.DNA是遺傳物質(zhì)1944年Avery，確定了基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質(zhì)。1952年AlfredHershy和MarshaChase進(jìn)一步證明遺傳物質(zhì)是DNA。2.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)1953年JamesD.Wat

2、son和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)制。3、中心法則與遺傳密碼1957年Crick又提出了遺傳信息傳遞的“中心法則”1964年MarshallNirenberg和GobindKhorana等終于破譯了64個(gè)遺傳密碼在遺傳學(xué)上，把遺傳信息的流動(dòng)方向叫做信息流。信息流的方向可以用科學(xué)家克里克提出的“中心法則”來表示。從“中心法則”可以看出，遺傳信息的一般流動(dòng)方向（圖中紅線所示）是：遺傳信息可以從DNA流向DNA，即完成DNA的自我復(fù)制過程，也可以從DNA流向RNA，進(jìn)

3、而流向蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2,RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法)的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenentcells)。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。三、基因工程誕生的技術(shù)突破1.限制性內(nèi)切酶（restrictionenzymes）1970年H.O.Smith等分離出第一種限制性核酸內(nèi)切酶。2.DNA連接酶（ligase）1967年5

4、個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶。3.載體（vector）1972年前后使用小分子量的細(xì)菌質(zhì)粒和l噬菌體作載體。在細(xì)菌細(xì)胞里的大量擴(kuò)增。4.感受態(tài)體系1970年M.Mandel和A.Higa發(fā)現(xiàn)經(jīng)過氯化鈣處理的大腸桿菌容易吸收噬菌體DNA。1972年S.Cohen發(fā)現(xiàn)這種處理過的細(xì)菌同樣能吸收質(zhì)粒DNA。5.瓊脂糖凝膠電泳1960s發(fā)明了瓊脂糖凝膠電泳，可將不同長(zhǎng)度的DNA分離開。6.DNA測(cè)序技術(shù)1975年F.Sanger、A.Maxam和W.Gilbert發(fā)明了DNA快速測(cè)序技術(shù)。四、基因工程的特征1.

5、跨物種性外源基因到另一種不同的生物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行繁殖。2.無性擴(kuò)增外源DNA在寄主細(xì)胞內(nèi)可大量擴(kuò)增，和高水平表達(dá)。五、基因工程的主要操作內(nèi)容1.目的基因的獲取從復(fù)雜的生物基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。2.重組體的制備將目的基因的DNA片斷插入到能自我復(fù)制并帶有選擇性標(biāo)記（抗菌素抗性）的載體分子上。3.重組體的轉(zhuǎn)化將重組體（載體）轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中。4.克隆鑒定挑選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞克?。ê心康幕颍?.目的基因表達(dá)使導(dǎo)入寄主細(xì)胞的目的基因表達(dá)出我們所需要的基因產(chǎn)物。第

6、一節(jié)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備溫度控制系統(tǒng)n冰箱：40C、-200C、-700Cn恒溫培養(yǎng)箱：隔水式、電熱式n鼓風(fēng)干燥箱n恒溫水浴n低溫循環(huán)水浴n微量加熱器n恒溫空氣搖床nPCR熱循環(huán)儀n制冰機(jī)n冷庫n高壓蒸汽滅菌器電泳設(shè)備u瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)u垂直板凝膠電泳系統(tǒng)u轉(zhuǎn)移電泳系統(tǒng)u紫外分析儀u凝膠成像系統(tǒng)離心設(shè)備u臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)u高速冷凍離心機(jī)u大容量離心機(jī)u超速離心機(jī)分光光度計(jì)722S、7200可見分光光度計(jì)紫外可見分光光度計(jì)其它nPH計(jì)n電子天平n旋渦振蕩器n磁力攪拌器n超聲波破碎儀n超凈工作臺(tái)n純水器第

7、一章基因工程的主要技術(shù)原理第一節(jié)DNA的提取與純化由于提取DNA的目的、種類、所用的生物、組織材料、實(shí)驗(yàn)條件等不同，DNA的提純有很多方法。其中最常用的是堿抽提法。一、質(zhì)粒DNA的提?。ㄒ唬①|(zhì)粒載體概念細(xì)菌質(zhì)粒是獨(dú)立于宿主基因組復(fù)制、編碼抗生素抗性基因的小型環(huán)狀DNA分子、運(yùn)載克隆DNA的常用載體。質(zhì)粒特點(diǎn)：染色體外的小型環(huán)狀分子，大小約為2—200kb，通常以多拷貝(可多達(dá)幾百個(gè))形式存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒含有復(fù)制起點(diǎn)(ori)用以保證質(zhì)粒的自主復(fù)制正常復(fù)制依賴宿主細(xì)胞中的聚合酶及其他成分。質(zhì)粒一般僅攜有

8、幾個(gè)基因抗生素物質(zhì)的抗性基因。最常見的抗性基因是amp+基因，編碼可以降解青霉素類抗生素如氨芐青霉素的β—內(nèi)酰胺酶。另一種常見抗性基因是tetA基因，編碼一種可以從細(xì)胞內(nèi)將四環(huán)素類抗生素排出的跨膜蛋白。pMD-18TVectorpGEMT(二)、質(zhì)粒DNA的制備小量法：堿裂解法（11分30秒）大量法：CsCl密度梯度離心法（1分30秒）試劑盒：由于質(zhì)粒遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于大腸桿菌染色體DNA，可以用物理化學(xué)方法