核酸分離和純化

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1、第三章核酸的分離與純化張暉醫(yī)學(xué)二系生化與分子生物學(xué)教研室BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege第一節(jié)主要內(nèi)容一、材料和方法的選擇二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)核酸分離純化過程三、核酸的鑒定和保存BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege無論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對(duì)核酸進(jìn)行分離和純化。前言BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege一、材料和方法

2、的選擇（掌握）（一）材料的選擇BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege2、清除其他分子的污染所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。（二）選擇分離方法的原則1、保持核酸堿基序列的完整性BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege（三）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性1、溫度不要過高2、控制pH值范圍(pH值5-9)3、避免自身酶對(duì)核酸的水解4、減少理化因素對(duì)核酸的機(jī)械剪切力Bioc

3、hemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)(熟悉)核酸的釋放核酸的分離與純化核酸的濃縮、沉淀步驟越多，純度越高，得率越低。BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege（一）細(xì)胞的破碎（了解）1、高速組織搗碎機(jī)搗碎2、超聲波處理法BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege3、液氮研磨法4、化學(xué)處理法(SDS、LDS，吐溫80等）5、生化法（溶

4、菌酶、纖維素酶等）BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負(fù)靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結(jié)合)、氫鍵和非極性的范德華力。分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時(shí)避免核酸降解。（SDS，酚/氯仿抽提）（二）核酸的分離和純化(了解)BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege（三）核酸的沉淀（了解）優(yōu)點(diǎn)：①很容易將核酸調(diào)整到所需濃度②去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)沉淀

5、是濃縮核酸最常用的方法。常用的沉淀有機(jī)溶劑：乙醇、異丙醇、聚乙二醇BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege三、核酸的鑒定和保存（掌握）（1）紫外分光光度法測(cè)DNA和RNA的濃度前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測(cè)定濃度應(yīng)大于0.25μg/ml。結(jié)論：在波長(zhǎng)260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA為37μg/ml；RNA為40ug/ml。（一）核酸的鑒定1.濃度鑒定Bioch

6、emistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege（2）熒光光度法（電泳法）原理：熒光染料溴化乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，DNA、RNA在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅色熒光，熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege2、純度的鑒定分析1)OD260/OD280大于標(biāo)準(zhǔn)值，表明DNA中有RNA污染。2)OD260/OD280小于標(biāo)準(zhǔn)值，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染；OD260/OD280DNA

7、應(yīng)為1.8RNA應(yīng)為2.0（1）DNA和RNA純度的鑒定(紫外分光法)注：可能出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液，比值為1.8的情況。BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege（2）熒光光度法BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege（二）核酸的保存(2)對(duì)RNA樣品的保存方法RNA樣品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70℃保存;(1)對(duì)DNA樣品的保存方法DNA樣品

8、溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege思考題？核酸分離純化的基本步驟和注意事項(xiàng)有哪些？BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege謝謝大家！BiochemistryDepartmentofZhejiangmedicalcollege