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1、第五章核酸的分離純化溫州醫(yī)學院彭穎DNA和RNA是生物體中最重要的核酸分子，是分子生物學和分子診斷的研究對象DNA和RNA的分離純化是分子生物學研究及分子診斷最基礎的工作第五章核酸的分離純化核酸分離純化的原則:保持核酸一級結構的完整性盡可能提高核酸制品的純度第五章核酸的分離純化第一節(jié)核酸分離純化的設計及原則第二節(jié)基因組DNA的分離純化第三節(jié)質粒DNA的提取與純化第四節(jié)RNA的分離純化第五章核酸的分離純化第一節(jié)核酸分離純化的設計及原則一、材料與方法的選擇二、技術路線的設計三、核酸的鑒定與保存第一節(jié)核酸分離純
2、化的設計及原則一、材料與方法的選擇（一）材料與方法的選擇（二）選擇原則（一）材料與方法的選擇不同的研究目的對核酸的完整性、純度、產(chǎn)量及濃度有不同的要求。需考慮制備核酸所需的時間與成本應選擇安全的試劑與制備方案一、材料與方法的選擇1.保持核酸堿基序列的完整性2.盡量清除其它分子的污染，保證核酸純度3.保持核酸的完整性盡量簡化分離純化步驟，縮短提取時間盡量避免各種有害因素對核酸的破壞（二）選擇原則一、材料與方法的選擇二、技術路線的設計（一）核酸的釋放（二）核酸的分離與純化（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌（一）核酸
3、的釋放DNA和RNA均位于細胞內(nèi)（病毒除外），因此核酸分離與純化的第一步即是裂解細胞、釋放核酸。二、技術路線的設計應該清除的雜質主要包括:1.非核酸的大分子污染物蛋白質、多糖及脂類物質等2.非需要的核酸分子分離某一核酸分子時，其它核酸皆為雜質3.加入的有機溶劑和某些金屬離子（二）核酸的分離與純化二、技術路線的設計（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀是濃縮核酸最常用的方法常用的鹽類:醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、氯化鉀及氯化鎂常用的有機溶劑:乙醇、異丙醇和聚乙二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的鹽，需用70%～7
4、5%的乙醇洗滌去除二、技術路線的設計三、核酸的鑒定與保存（一）核酸的鑒定（二）核酸的保存（一）核酸的鑒定1.濃度鑒定2.純度鑒定3.完整性鑒定三、核酸的鑒定與保存紫外分光光度法：核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結構，可以吸收紫外線，其最大吸收波長為260nm。1.濃度鑒定三、核酸的鑒定與保存各種堿基的紫外吸收光譜三、核酸的鑒定與保存熒光光度法：核酸的熒光染料溴化乙錠嵌入堿基平面后，本身無熒光的核酸在UV激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。熒光強度的積分與溶液中核酸的含量呈正比。三、核酸的鑒定與保存EB與DNA的結合三、核酸的
5、鑒定與保存紫外分光光度法：主要通過A260與A280的比值來判定有無蛋白質的污染。比值升高或降低均提示制備的核酸純度不佳。2.純度鑒定三、核酸的鑒定與保存1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相當于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0三、核酸的鑒定與保存熒光光度法：EB等熒光染料示蹤的核酸電泳可判定核酸制品的純度。三、核酸的鑒定與保存瓊脂糖凝膠電泳：以
6、EB為示蹤劑的核酸凝膠電泳可判定核酸制品的完整性基因組DNA如果發(fā)生降解，電泳圖呈拖尾狀3.完整性鑒定三、核酸的鑒定與保存DNA的降解三、核酸的鑒定與保存完整的或降解很少的總RNA電泳圖譜中，三條帶熒光強度應呈特定的比值。沉降系數(shù)大，電泳遷移率低，熒光強度高沉降系數(shù)小，電泳遷移率高，熒光強度低三、核酸的鑒定與保存28S（或23S）RNA的熒光強度一般約為18S（或16S）RNA的2倍，否則提示有RNA的降解若在點樣孔附近有著色條帶，提示可能存在DNA的污染三、核酸的鑒定與保存三、核酸的鑒定與保存（二）核酸
7、的保存1.DNA的儲存2.RNA的儲存三、核酸的鑒定與保存溶于TE緩沖液中的DNA在-70℃冰箱可保存數(shù)年。TE的pH為8.0時，DNA的脫氨反應減少，pH低7.0時DNA易變性。1.DNA的保存（二）核酸的保存三、核酸的鑒定與保存2.RNA的保存三、核酸的鑒定與保存RNA溶于H2O或0.3mol/L的NaAc溶液中，-70℃保存RNA溶液中加入RNasin或VRC，可延長保存時間用于配置試劑及溶解RNA的H2O均應經(jīng)DEPC處理第二節(jié)真核基因組DNA的分離純化生物體組織細胞玻棒纏繞法酚抽提法基因組DNA
8、粗品PFGE分離特定的DNA片段AGE分離PAGE分離乙醇沉淀洗滌基因組DNA純品精分離粗分離前處理離子交換層析純化有機溶劑抽提細胞裂解蛋白質變性沉淀降解DNA釋放甲酰胺解聚法哺乳動物基因組DNA分離純化的一般技術路線第二節(jié)真核基因組DNA的分離純化第二節(jié)真核基因組DNA的分離純化一、酚抽提法二、甲酰胺解聚法三、玻棒纏繞法四、其它方法五、DNA片段的純化六、DNA片段的回收一、酚抽提法1976年由Stafford及其同事創(chuàng)立，
