《基因克隆原核表達(dá)》PPT課件

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1、基因的克隆與表達(dá)山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所馬春紅基因克隆(geneclonging)基因表達(dá)(geneexpression)-原核基因表達(dá)-真核基因表達(dá)基因克隆GeneCloning概述克隆載體受體細(xì)胞體外重組的策略基因克隆工作流程一、概述1973年Cohen完成第一個基因工程實(shí)驗(yàn)經(jīng)體外重組獲得雜合DNA雜合子轉(zhuǎn)化入大腸桿菌所需元件：限制性內(nèi)切酶連接酶載體受體細(xì)胞基因克隆（分子克隆molecullarcloning）----通過體外重組技術(shù),將一段目的DNA經(jīng)切割、連接插入適當(dāng)載體，并導(dǎo)入受體細(xì)胞，擴(kuò)增形成大量子

2、代分子的過程?；蚩寺〉暮诵?----體外重組(Recombination):人工將一段目的DNA插入一個載體的過程?；蚩寺〉募夹g(shù)路線目的基因載體體外重組重組子（雜合DNA）轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞篩選陽性克隆大量擴(kuò)增，獲得子代DNA二、克隆載體三、受體細(xì)胞1、定義：外源DNA導(dǎo)入的細(xì)胞，是重組體擴(kuò)增的場所。2、要求：易于接納外源DNA無特異的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶載體復(fù)制、擴(kuò)增不受阻與載體有互補(bǔ)性四、體外重組的策略1、粘末端連接1）全同源粘末端連接最方便簡單高背景-載體自身環(huán)化雙向插入2）定向克?。菏雇庠椿蚨ㄏ虿迦氲捷d體中的

3、克隆策略粘-粘連接：最有效、最快捷粘-平連接：適用于外源基因僅與載體有一個相同酶切位點(diǎn)，可將另一末端補(bǔ)平2、平末端連接：酶切點(diǎn)為平末端或任何兩個末端補(bǔ)平的DNA效率低，酶用量大3、人工接頭連接人工接頭：人工合成含有酶切位點(diǎn)的寡核苷酸片段4、T-A克隆T-vector兩條鏈的5’端含有一個游離的TPCR過程中，增加延伸時間，Taq酶可在產(chǎn)物的3’端多加一個A五、基因克隆的工作流程（一）目的基因的獲得1、直接分離3、構(gòu)建cDNA文庫4、PCR5、人工合成6、差異顯示1、直接分離DNA—適用于克隆原核生物的基因組文庫2

4、、構(gòu)建基因組文庫，篩選目的基因基因組文庫(genelibrary)：將某種生物的基因組DNA切割成一定大小的片段，并與合適的載體重組后導(dǎo)入宿主細(xì)胞，進(jìn)行克隆。這些存在于所有重組體內(nèi)的基因組DNA片段的集合，即基因組文庫，它包含了該生物的所有基因。構(gòu)建流程抽提基因組DNA鳥槍法制備DNA片段DNA片段與載體重組轉(zhuǎn)化宿主菌篩選目的基因（核酸探針法、免疫結(jié)合法）特點(diǎn)及應(yīng)用：包含所有遺傳信息構(gòu)建難度大（單拷貝基因、長片段基因）篩選難度大用于研究基因在基因組中的情況3、構(gòu)建cDNA文庫，篩選目的基因cDNA文庫(compl

5、ementaryDNAlibrary)以組織細(xì)胞中的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，各cDNA分子分別插入載體形成重組子，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞克隆擴(kuò)增。這些在重組體內(nèi)的cDNA的集合即cDNA文庫。cDNA文庫僅包含正在表達(dá)的基因不同物種、不同組織的cDNA文庫不相同基因總量少，易篩選4、PCR擴(kuò)增目的基因片段適用于克隆序列清楚的基因以基因組DNA為模板，直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增較難多采用以mRNA為模板的RT-PCR法5、人工合成較短的DNA6、差異顯示法(differentialdisplay,DD)—篩選差異表

6、達(dá)的基因（二）體外重組連接體系的建立：溫度：粘末端連接：12-18℃平末端連接：室溫（低于30℃)DNA量：載體分子數(shù)/目的基因分子數(shù)=1：1-3酶量：平端連接時需加大酶量（三）轉(zhuǎn)化—Cacl2法、電擊法（四）重組子的篩選及鑒定1、篩選：平板法（抗生素、藍(lán)白斑）原位雜交2、鑒定：長度鑒定：酶切、PCR方向鑒定：聯(lián)合酶切測序原核基因表達(dá)系統(tǒng)一．表達(dá)系統(tǒng)：基因工程中用來獲得有功能的異源蛋白質(zhì)的體系，包括克隆載體，表達(dá)載體及受體細(xì)胞。據(jù)受體細(xì)胞的不同可分為：1．原核表達(dá)載體系統(tǒng)：將外源基因引入原核細(xì)胞，并使其在原核細(xì)胞

7、中以發(fā)酵形式快速高效地表達(dá)、合成基因產(chǎn)物的體系。2．真核表達(dá)系統(tǒng)：使外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)的體系。二．原核生物基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)特點(diǎn)原核生物染色體DNA是裸露的環(huán)形DNA，其轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的連續(xù)進(jìn)行。原核生物形成多順反子mRNA：mRNA在合成過程中和多個核糖體結(jié)合，翻譯形成多條肽鏈。多順反子mRNA（polycistronicmRNA）：即可作為兩個或多個肽鏈翻譯模板的mRNA3、一般不含內(nèi)含子（intron），沒有轉(zhuǎn)錄及翻譯后加工系統(tǒng)4、原核生物中功能相關(guān)的基因串聯(lián)在一起，形成操縱子。操縱子（operon）：

8、是一組功能上相關(guān)，受同一調(diào)控區(qū)控制的基因組成的一個遺傳單位原核生物基因表達(dá)的基本單位（即一個轉(zhuǎn)錄單位）。共同協(xié)調(diào)作用，完成某一多肽的表達(dá)調(diào)控。包括：調(diào)控區(qū)(調(diào)節(jié)基因，啟動基因，操作基因)、結(jié)構(gòu)基因：5、原核生物中參與轉(zhuǎn)錄的基因結(jié)構(gòu)：啟動子終止子啟動子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。一般長40-60bp，富含A-T鹼基對