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《節(jié)律基因mPeriod2抑制腫瘤細(xì)胞生長的體內(nèi)外研究》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、四Jfl丈學(xué)博士論文節(jié)律基因mPeriod2抑制腫瘤細(xì)胞生長的體內(nèi)外研究生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)研究生：華慧指導(dǎo)教師：王正榮教授腫瘤是威脅人類健康的重大疾病之一，發(fā)病率居lO種重大疾病的第二位。雖然腫瘤的診治取得了很多進(jìn)展，但對腫瘤患者的長期療效仍然亟待提高。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和對人體腫瘤的研究均表明生物節(jié)律參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本項(xiàng)目立足于研究近日節(jié)律核心基因mPeriod2(mPer2)和腫瘤的關(guān)系。探討節(jié)律基因mPer2在腫瘤細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)或低表達(dá)對腫瘤細(xì)胞生長和凋亡的影響，并深入研究其機(jī)制，進(jìn)而尋求治療腫瘤的新方向。尸B力作為近日節(jié)律鐘控系統(tǒng)的
2、一個(gè)必不可少的組成部分，不僅調(diào)節(jié)近日節(jié)律．同時(shí)還影響器官功能。我們首先研究了Per2在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)是否影響癌細(xì)胞生長或凋亡．本研究采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法，將roPer2真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3．1(+)-mPer2和空質(zhì)粒pcDNA3．1(+)轉(zhuǎn)染Xd,鼠Lewis肺癌細(xì)胞株(Lewislungcarcinomacell，LLC)、小鼠乳腺癌細(xì)胞株(mousemammarycarcinomacell，EMT6)和NIH3T3細(xì)胞，采用MTT法、光鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞平板集落形成實(shí)驗(yàn)等方法研究mPer2過表達(dá)對小鼠腫瘤細(xì)胞
3、LLC和EMT6細(xì)胞增殖的作用。利用流式細(xì)胞術(shù)、基因組DNA片斷分析、Hoeehst33342染色和電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)等方法研究mPer2過表達(dá)對小鼠腫瘤細(xì)胞LLC、EMT6細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞凋亡的作用。本研究證實(shí)過表達(dá)roPer2能明顯抑制小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株和小鼠乳腺癌細(xì)胞株的生長增殖，并能明顯誘導(dǎo)以上腫瘤細(xì)胞凋亡，但對正常細(xì)胞卻無誘導(dǎo)凋亡作用。細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)roPer2過表達(dá)引起小鼠腫瘤細(xì)胞LLC、EMT6細(xì)胞Gl期阻滯。roPer2過表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核DNA降解。呈現(xiàn)典型的DNALadder區(qū)帶特征，Ho
4、echst33342染色發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞明顯增多。電子顯微鏡觀察到mPer2過表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞核染色質(zhì)凝集，呈明顯碎塊狀致密濃染。四川大學(xué)博士論文此外，為了解下調(diào)內(nèi)源性mPer2基因表達(dá)對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，我們首先用lOOnMTPA處理LLC細(xì)胞以誘導(dǎo)內(nèi)源性mPer2基因表達(dá)，其中一組僅用TPA處理，一組同時(shí)用TPA和隨機(jī)反義寡核苷酸，另一組用TPA和mPer2反義寡核苷酸處理。處理后24小時(shí)，將細(xì)胞在血清饑餓條件下繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，然后收集細(xì)胞，固定，行流式細(xì)胞分析，檢測以上三組細(xì)胞凋亡情況。另用RT-PCR檢測m
5、Per2基因表達(dá)情況．與僅用TPA處理組和TPA聯(lián)合隨機(jī)反義寡核苷酸處理組相比，mPer2反義寡核苷酸處理抑制了TPA誘導(dǎo)的mPer2基因表達(dá)。流式細(xì)胞分折表明抑制內(nèi)源性mPer2基因表達(dá)可顯著降低血清饑餓所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡．這些結(jié)果從另一個(gè)側(cè)面證實(shí)了mPer2基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡．為了進(jìn)一步探討節(jié)律基因mPer2過表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞生長和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本研究采用RT-PCR、蛋白印跡和流式細(xì)胞術(shù)等方法研究mPer2過表達(dá)對小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株(LLC)凋亡相關(guān)基因如p53，c-Myc、Bcl-2，BcI-XL和Bax等基因m
6、RNA和蛋白表達(dá)的影響。RT-PCR結(jié)果顯示mPer2過表達(dá)對LLC細(xì)胞c-Myc，Bcl-2和Bcl-XL基因的mRNA表達(dá)具明顯的抑制作用，同時(shí)可增強(qiáng)p53和Bax基因的mRNA表達(dá)．蛋白印跡和流式細(xì)胞術(shù)檢測都顯示mPer2過表達(dá)可明顯降低LLC細(xì)胞c-Myc、Bcl-2和BcI．)(L的蛋白表達(dá)水平，同時(shí)明顯增強(qiáng)p53和Bax的蛋白表達(dá)水平．這些結(jié)果表明PER2的促凋亡作用是因?yàn)槠湓鰪?qiáng)了促凋亡的信號傳導(dǎo)和削弱了抑制凋亡的基因。除了以上體外試驗(yàn)外，我們也觀察了PER2對Lewis肺癌在小鼠體內(nèi)生長的影響．采用小鼠Lewis肺癌細(xì)
7、胞株(UC)于C57BL／6小鼠右前肢腋窩皮下接種，建立C57BL／6小鼠移植瘤模型。小鼠以12小時(shí)光照，12小時(shí)黑暗交替(LDl2／12)提供光源照制2周。隨機(jī)分組，雌雄各半．采用pcDNA3．1(+)與體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑混合物、pcDNA3．1(+)．mPer2與體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑混合物在移植瘤內(nèi)多點(diǎn)注射．10天后收集標(biāo)本，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組移植瘤細(xì)胞的周期及凋亡率，免疫組化法分析PCNA蛋白表達(dá)．結(jié)果顯示。pcDNA3．1(+)．mPer2組瘤重明顯低于pcDNA3．1(+)對照組，抑瘤率為51．7％．免疫組化結(jié)果提示pcDNA3．1
8、(+)．mPer2組PCNA表達(dá)明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P
