同型半胱氨酸對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1表達(dá)的影響

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1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人申明所呈交的學(xué)位論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得我校或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料，與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。申請(qǐng)學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任．論文作者簽名：．塞兇日期：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人完全了解中國(guó)醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即：研究生在攻讀學(xué)位期間論

2、文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬中國(guó)醫(yī)科大學(xué)．本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時(shí)署名單位為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，且導(dǎo)師為通訊作者，通訊作者單位亦署名為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱．學(xué)校可以公布學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容(保密內(nèi)容除外)，以采用影印、縮印或其他手段保存論文。論文作者簽名：弛指導(dǎo)教師簽名：辱譬囊啦(1畫麗]同型半胱氨酸對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體一1表達(dá)的影響目的高同型半胱氨酸(homocysteine，Hey)血癥是近年確立的動(dòng)脈粥樣硬化(a

3、therosclerosis，AS)的新的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但其致病機(jī)制還不十分清楚。由于冠心病嚴(yán)重威脅人類健康和生命，因此深入探討Hey致AS的機(jī)制具有重要的臨床意義。氧化低密度脂蛋白(oxidizedlowdensity]ipoprotein，Ox—LDL)在血管內(nèi)皮功能失調(diào)和AS中起著至關(guān)重要的作用。血凝紊樣氧化低密度脂蛋白受體一1([ectin—likeoxidizedlowdensitylipoproteinreceptor—l，LOX一1)是OxLDL在血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異受體，它的可誘導(dǎo)表達(dá)介導(dǎo)了OxLDL的多種致As作用

4、。本研究應(yīng)用Hcy與培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialceUs，HUVECs)共同孵育，通過觀察Hcy對(duì)HUVECs上LOX一1表達(dá)的影響來深入探討Hcy致AS的可能分子機(jī)制。方法I、細(xì)胞培養(yǎng)：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV3(}4)常規(guī)傳代培養(yǎng)于10％胎牛血清一1640培養(yǎng)基中，37℃，5％C02，飽和濕度。2、實(shí)驗(yàn)分組：將常規(guī)傳代的HUVECs接種子25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，待均勻鋪滿瓶底后，加入無血清1640孵育24h，然后隨機(jī)分為：(1)Hcy不同濃度組：對(duì)照組加無血清1640，實(shí)驗(yàn)組

5、加Hcy，終濃度分別為0．Ol、0．05、0．1、0．5、1、5retool／L(mM)，孵育24h。(2)ImMHcy不同時(shí)間組：分別孵育0、612、24、48h，0h做為對(duì)照。3、應(yīng)用RT—PCR方法檢測(cè)LOX—lmRNA表達(dá)：(1)細(xì)胞總RNA的提·1·?。好科考?xì)胞中加入ImlTRIzol試劑，提取總RNA并提純。(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。(3)PCR擴(kuò)增：以cDNA為模板擴(kuò)增LOX一1的基因片段，以B—actin為內(nèi)參照。(4)PCR產(chǎn)物的檢出及半定量：取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果置于凝

6、膠成像分析儀上成像，以B—actin平均積分吸光度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正，對(duì)LOX—lmRNA表達(dá)進(jìn)行半定量分析。4、應(yīng)用Westernblot方法檢測(cè)LOX一1蛋白表達(dá)：將提取的蛋白在10％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、先后同一抗和二抗雜交、顯色，結(jié)果掃描成像后進(jìn)行灰度值分析，以對(duì)照組的灰度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正。計(jì)算LOX—l蛋白的相對(duì)表達(dá)量。5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)采用受±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P

7、與對(duì)照組相比無明顯差異(P>0．05)；較大濃度組(0．05—5ram)LOX—lmRNA表達(dá)量明顯升高(P<0．05)，且呈濃度依賴性。(2)1mMHcy不同時(shí)間組：與對(duì)照組相比，細(xì)胞加入Hcy6h后LOX一1mRNA表達(dá)開始明顯增加(P0．05)；0．05—5ram組的LOX一1蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0．05)，分別為對(duì)照組的1．21、1．85

8、、2．40、3．34、3．97和4．89倍。(2)1mMHcy不同時(shí)間組：細(xì)胞加入Hcy后LOX一1蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0．05)，6h、12h、24h、48h分別為對(duì)照組(Oh)的1．67、3．37、4．12和4．30倍。達(dá)。結(jié)論l、Hey可