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1、河北醫(yī)科大學碩士學位論文車前子多糖對氧化型低密度脂蛋白致人臍靜脈內皮細胞損傷的保護作用姓名：車文文申請學位級別：碩士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：王素敏20090301中文摘要車前子多糖對氧化型低密度脂蛋白致人臍靜脈內皮細胞損傷的保護作用摘要動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是危害人類健康的主要疾病之一。對AS防治藥物的研究一直是基礎和臨床研究的重要課題。高脂血癥被認為是AS的高危因子之一，其中氧化型低密度脂蛋I芻(oxidizedLowdensityLipoprotein，OX．LDL)是致AS發(fā)生的始動因素，它通過脂質過氧化作用導致內皮細
2、胞受損、分泌多種細胞活性因子和生長因子，促進平滑肌細胞增殖、單核細胞粘附、血小板聚集和泡沫細胞形成，最終導致粥樣斑塊形成。因此，抑帶tJox．LDL的生成或降低ox．LDL對機體的損傷是預防AS發(fā)生發(fā)展的關鍵?，F今臨床主要應用血管緊張素轉換酶抑制劑(ACE—I)、D．受體阻滯劑、降脂藥、超氧化物歧化酶(SOD)等藥物治療，以試圖改善患者受損的內皮功能。但其治療存在兩個主要問題：1、阻斷正常生理功能運行所需的物質；2、大部分藥物對肝臟、腎臟有毒副作用。西方現代醫(yī)學認為，AS是屬于病因未明的疾病，最好采用緩解和抑制癥狀為主的醫(yī)療策略。中藥作為人類維護健康體系的一個重要組
3、成部分，大多數是天然藥物，符合“返璞歸真"、“回歸自然”的潮流，與生物一心理一社會醫(yī)學模式相適應。中國藥典記載，車前子為車前科(Plantaginceae)植物車前的干燥成熟種子。現代藥理學研究表明車前子不僅具有清腸通便、降低血脂、調節(jié)血糖、免疫調節(jié)的功效，還能抑制脂質過氧化物及自由基的產生，并對動中文摘要脈血管壁的重構有重要作用。但是否能改善內皮功能損傷尚不清楚，本實驗采用現代技術手段從車前子中提取得到有效成分車前子多糖(plantainseedpolysaccharide,尸．鏟)，通過OX．LDL對培養(yǎng)的內皮細胞體外直接損傷，探討船r尸對損傷血管內皮細胞的保護
4、作用及可能機制，為AS的防治提供進一步的理論依據。一人臍靜脈內皮細胞的體外培養(yǎng)及其鑒定目的：建立簡單有效且重復性高的人臍靜脈內皮細胞(HumanUmbilicalVeinEndothelialCells，HUVECs)體外原代及傳代培養(yǎng)技術，并對培養(yǎng)的細胞進行鑒定，為進一步研究內皮細胞功能提供重要的實驗方法。方法：(1)配制培養(yǎng)液：分別配制含10％和20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，然后加入終濃度為15ng／mlVEGF、100U／ml青、鏈霉素，用前調節(jié)pH值7．O~7．2。(2)HUVECs的原代分離培養(yǎng)：取臍帶(大于20cm)，采用I型膠原酶灌注消化法在臍靜脈中
5、分離內皮細胞，用含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。(3)HUVECs的傳代培養(yǎng)：原代分離的HUVECs生長匯合至80％后，胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。(4)HUVECs的鑒定：①倒置顯微鏡下每日觀察細胞形態(tài)、貼壁及生長情況；②人第Ⅷ因子相關抗原抗體免疫組化檢測。結果：(1)HUVECs生長情況及形態(tài)學變化：①生長時間：原代分離的內皮細胞2h左右開始貼壁生長，細胞為扁平多角形，24h完全貼壁，變成梭形，7～10d細胞融合成單層；傳代細胞分布較均勻，O．5h左右開始貼壁生長，3-'-'5d長成單層，細胞匯合成典型的鋪路石狀。②細胞形態(tài)：
6、原代培養(yǎng)時，倒中文摘要置顯微鏡下可見細胞呈小三角形、圓形，多數細胞聚集成團。生長活躍期細胞，呈橢圓形或圓形，邊界清楚、胞質豐富，內含小顆粒。傳代細胞較原代細胞生長快，細胞密集，分散均勻，倒置顯微鏡下可見細胞呈短梭形或多角形，胞核變圓，呈鋪路石狀排列，細胞周圍近胞核處可見明顯光暈，為典型的內皮細胞生長特點，可以確定所培養(yǎng)的細胞為內皮細胞。(2)第Ⅷ因子相關抗原抗體免疫組化檢測：細胞呈圓形、橢圓形或梭形，胞漿豐富，胞質內有棕黃色的染色顆粒，細胞核不著色，呈陽性反應；而對照組(力NPBS液)胞質內無棕黃色的染色顆粒，呈陰性反應，可進一步確認所分離培養(yǎng)的細胞是內皮細胞。結論
7、：血管內皮細胞可從胎兒臍帶中利用O．1％I型膠原酶灌注，在37℃水平搖床上消化10min的方法分離獲得，并且通過原代和傳代培養(yǎng)成為細胞系，倒置顯微鏡下觀察到細胞周圍近胞核處可見明顯光暈，為典型的內皮細胞生長特點，可以確定為內皮細胞；并利用人第Ⅷ因子抗原抗體免疫組化法檢測，進一步鑒定證實培養(yǎng)的細胞是血管內皮細胞。二車前子多糖對氧化型低密度脂蛋白致人臍靜脈內皮細胞損傷的保護作用目的：利用OX．LDL對培養(yǎng)的HUVECs造成脂質過氧化損傷，觀察PSP對其保護作用和探討其可能的機制。方法：用MTT方法和化學方法從細胞水平觀察OX．LDL對細胞增殖活性及細胞上清液中一氧化
