蒲黃提取物對氧化低密度脂蛋白損傷血管內皮細胞的保護作用

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1、蒲黃提取物對氧化低密度脂蛋白損傷血管內皮細胞的保護作用【摘要】目的研究蒲黃提取物對氧化低密度脂蛋白(oxLDL)損傷人臍靜脈內皮細胞的保護作用。方法體外培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，采用MTT法測定不同濃度蒲黃提取物對HUVEC的影響。以蒲黃提取物(100，50，10mg/L)預處理細胞24h，再加入100mg/LoxLDL造成細胞損傷，取培養(yǎng)細胞上清液測定乳酸脫氫酶(LDH)活性，HUVEC用于測定細胞細胞間黏附因子(ICAM1)、單核細胞趨化蛋白(MCP1)mRNA的表達。結果各劑量蒲黃提取物有顯著的促進血管內皮細胞增殖的作用。與正常對照組比較，HUVEC經(jīng)oxLDL作

2、用后，細胞活性顯著下降，LDH的釋放量和ICAM1、MCP1mRNA的表達顯著升高;100、50、10mg/L蒲黃提取物可顯著降低LDH活性,下調ICAM1、MCP1mRNA的表達。結論蒲黃提取物具有促進臍靜脈內皮細胞增殖的作用，并可抑制OxLDL誘導的HUVECsICAM1、MCP1mRNA表達的上調和LDH的釋放，從而起到保護血管內皮細【關鍵詞】蒲黃提取物;內皮細胞;氧化低密度脂蛋白;細胞間黏附分子1;單核細胞趨化蛋白1;乳酸脫氫酶血管內皮細胞損傷是動脈粥樣硬化(AS)形成的始動環(huán)節(jié)〔1〕。氧化低密度脂蛋白(oxLDL)是低密度脂蛋白致AS的關鍵步驟,可作為心血管疾

3、病獨立的危險因素直接損傷血管內皮細胞(VEC)〔2〕，損傷后的VEC合成和分泌的血管活性物質和細胞因子間平衡遭到破壞，導致內皮功能發(fā)生障礙，促使單核細胞與VEC黏附，這些改變對AS的形成起著始動的作用。蒲黃為香蒲科植物水燭香蒲、東方香蒲或其同屬植物的花粉，具有活血化瘀、止血、通淋之功效，對AS等多種心血管疾病具有良好的療效。以往研究表明〔3，4〕，蒲黃提取物其具有降血脂、抗血小板聚集與抗血栓、增加冠脈流量及通過降脂來保護內皮細胞等作用。本研究以體外培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)用oxLDL造成內皮細胞損傷模型，通過測定內皮細胞形態(tài)及功能的變化，探討蒲黃提取物保護血管內皮、抗AS的機制

4、。　　1材料與方法　　1.1儀器低溫超速離心機(美國貝克曼公司);酶標儀(奧地利SUNRISE);DU800光分度計(美國貝克曼公司);PTC200DNA擴增儀、凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國BIORAD公司產(chǎn)品);電泳儀(北京六一儀器廠)?！　?.2試劑蒲黃(四川中藥飲片有限公司,由重慶桐君閣曾憲策主任中藥師鑒定為正品);胰酶(美國Gibco公司);內皮細胞生長添加物(美國BD公司);DMEM低糖培養(yǎng)粉(美國Gibco公司);優(yōu)級胎牛血清(美國Gibco公司);oxLDL(中山大學,含量:2mg/ml);乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所);四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲亞

5、砜(DMSD)(美國Sigma公司)?！　?.3蒲黃提取物的制備取蒲黃200g，分別用70%乙醇回流提取3次，溶劑用量依次為8,6,6倍體積，提取時間為60,60,30min〔5〕。水浴濃縮得深褐色藥液，真空冷凍干燥，得黃色粉末，放置4℃保存?zhèn)溆?。用時溶于DMSO中，制成含藥濃度為100mg/ml的母液，再用細胞培養(yǎng)液按照一定比例稀釋，使DMSO終濃度≤0.1%，用0.22μm濾器過濾除菌后使用?！　?.4HUVEC的培養(yǎng)及鑒定取健康產(chǎn)婦分娩胎兒的臍帶，75%酒精擦拭臍帶表面及斷端，剪去夾痕，用磷酸緩沖液(PBS)沖洗靜脈腔內殘血，灌入預熱0.25%胰酶和0.02%EDTA的混合消化液使之

6、充盈，放置于37℃水浴箱中消化8min后，收集消化液并用Hanks液沖洗靜脈，合并兩液，1000r/min離心10min，棄上清，以DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml、內皮細胞生長添加物100mg/L)重懸細胞后，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。待細胞貼壁后，換液1次，去除懸浮的死細胞和紅細胞，以后每2～3天換液，細胞長至亞融合后，用含0.125%胰酶和0.01%EDTA的混合消化液消化傳代，實驗用第3～4代細胞。培養(yǎng)的細胞形態(tài)符合VEC特征，Ⅷ因子抗體免疫熒光染色陽性?！　?.5MTT比色法檢測蒲黃提取物對VEC的作用將80

7、%融合生長的VEC以混合消化液消化，收集細胞，完全培養(yǎng)基稀釋后以2×104/L的密度接種于96孔板。正常培養(yǎng)24h后，洗去未貼壁細胞。換用無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細胞同步化。換用含5%胎牛血清的含不同濃度蒲黃提取物的DMEM培養(yǎng)液。蒲黃提取物以100mg/L為最大濃度，依次為75、50、25、10mg/L，共設5個濃度，每組8個復孔，并設對照組(含5%胎牛血清的培養(yǎng)基)及調零孔(5%胎牛血清培養(yǎng)基、MTT、二甲基