外源性TGFβ1對(duì)活化的大鼠肝星狀細(xì)胞內(nèi)Smads蛋白表達(dá)的影響

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1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人申明所呈交的學(xué)位論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也不包含為獲得我校或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過(guò)的材料，與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意．申請(qǐng)學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任．論文作者簦名：墨生EI攤I：迦￡：』：叢中國(guó)醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人完全了解中國(guó)醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即：研究生在攻讀學(xué)位期間論文工作的知識(shí)

2、產(chǎn)權(quán)單位屬中國(guó)醫(yī)科大學(xué)。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時(shí)署名單位為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，且導(dǎo)師為通訊作者，通訊作者單位亦署名為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容(保密內(nèi)容除外)，以采用影印、縮印或其他手段保存論文。論文作者簽名：指導(dǎo)教師簽名：。_“P??{中文論著摘要j、．_-．，．，．，●．-．．。．．·．．．·．．‘．_．．●．．?！?。．?！瘛?，一’外源性TGF—B。對(duì)活化的大鼠肝星狀細(xì)胞Smads蛋白表達(dá)的影響前言肝纖維化是指肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ex

3、traeellularmatrix，ECM)的過(guò)度沉積。近年來(lái)的研究表明，在眾多的致纖維化細(xì)胞因子中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子一B(transforminggrowthfactor一13，TGF一13)的促纖維生成作用最強(qiáng)；活化的肝星狀細(xì)胞(hepaticsteUatecell，HSC)則是肝臟內(nèi)最主要的纖維生成細(xì)胞。Smads蛋白家族作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，是迄今唯一已被證實(shí)的TGF一母受體(TGF—Dreceptor，T13R)作用底物。近年來(lái)，眾多研究已經(jīng)證實(shí)TGF—B在肝纖維化形成過(guò)程中的致纖維化作用。而Smads蛋白在這一過(guò)程中究竟充當(dāng)了什么角色，目前還不是

4、很清楚。本項(xiàng)研究運(yùn)用蛋白免疫印跡雜交方法(Westernblotting)研究在外源性TGF—B。的刺激下，體外培養(yǎng)的活化的大鼠HSC內(nèi)磷酸化Smad2或Smad3(phospho—Smad2or—Smad3，P—Smad2or—Smad3)與Smad7表達(dá)的變化，闡明有TGF—B，刺激的條件下，活化的大鼠HSC內(nèi)P—Smad2或一Smad3和Smad7這兩類細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白表達(dá)變化的特點(diǎn)，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)促肝纖維化的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制，為尋找防止肝纖維化新的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料與方法在本研究中，我們對(duì)活化的大鼠HSC進(jìn)行體外培養(yǎng)，然后分別選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的

5、不同的三代細(xì)胞，用含TGF—B，(濃度5rig／m／)的無(wú)血清HSC培養(yǎng)液與活化的大鼠HSC共同培養(yǎng)0小時(shí)、0．5小時(shí)、1小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)后，分別棄去培養(yǎng)液，先后加入細(xì)胞裂解液100“l(fā)、PMSF41xl、Aprotinin1止，于冰上靜置20分鐘，然后用橡皮刮將細(xì)胞刮下，收于微量離心管中，在4。CT，10000×g離心15分鐘，保留上清液，置于一130℃凍存待用。應(yīng)用Westemblotting方法檢測(cè)上述獲得的蛋白樣品中P—Smad2或Smad3和Smad7表達(dá)的情況。將獲得的蛋白電泳條帶用天能GIS凝膠圖象處理系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，用SP

6、SS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)以上結(jié)果進(jìn)行方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果TGF—t3,對(duì)活化大鼠HSC內(nèi)Sraads蛋白表達(dá)影響的研究采用TGF—B。(濃度為5ng／m1)與活化的大鼠HSC共同培養(yǎng)0小時(shí)、0．5小時(shí)、I小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)后，活化的大鼠HSC內(nèi)P—Smad2或Smad3／13一Actin檢測(cè)值分別為0．84±0．11、0．97±0．09、1．02±0．16、1．12±0．19、1．27±0．26、1．17±0．26；SmadT／f3一Actin檢測(cè)值分別為0．714-0．22、O．85±0．31、0．91±0．32、1．07-4-0．36、1．38±0．4

7、8和1．29±0．59。以上結(jié)果表明，經(jīng)外源性TGF—B，刺激后，活化的大鼠HSC內(nèi)P—Smad2或一Smad3與Smad7蛋白表達(dá)均呈一過(guò)性增加，并且它們的表達(dá)水平均在8小時(shí)達(dá)到高峰之后開始下降。經(jīng)方差分析，TGF—B，刺激8小時(shí)和24小時(shí)組P—Smad2或Smad3／13一Actin值與刺激0小時(shí)組比較有顯著性差異，P值分別為0．014和0．048，而與其他組比較無(wú)顯著性差異；總的F=4．667，P=0．034，也有顯著性差異。在相同的刺激條件下，SmadT／13一Actin4小時(shí)組和8小時(shí)組與刺激O小時(shí)組比較有顯著性差異，P值分別為0．049和0．0

8、02，而其他組之間比較元顯著性差異；并且Smad7總的F=3．74