《色譜分離技術(shù)》PPT課件

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1、第7章色譜分離技術(shù)7.1基本原理7.2分配色譜7.3凝膠過濾7.4離子交換7.5親和色譜7.1基本原理7.1.1概述1903年俄國植物學(xué)家茨維持(Цвет，Tswet)在填充碳酸鈣柱中用以石油醚沖洗植物色素萃取物，得到各色區(qū)帶;1931年氧化鋁柱中胡蘿卜素兩種同分異構(gòu)體的分離，表現(xiàn)出極高的分辨率;1944年出現(xiàn)紙層析;1950年代氣相色譜出現(xiàn)，色譜分離的儀器化1960年代高效液相色譜的發(fā)展，高效固定相填料獲得突破進(jìn)展隨著生物技術(shù)的發(fā)展，色譜分離已成為生物產(chǎn)品高度純化最有效的的方法之一。從多數(shù)生物產(chǎn)品純化工藝來講，色譜分離是產(chǎn)品包裝前的最后純化工序。色譜分離基本特點(diǎn)(1)分離效率

2、高是所有分離純化技術(shù)中最高的(不計(jì)電泳)。若用理論塔板數(shù)來表示柱效率，每米柱長可達(dá)103～105塊塔板。通常色譜柱長一般只有幾厘米至幾十厘米。(2)應(yīng)用范圍廣從極性到非極性、離子型到非離子型、小分子到大分子、無機(jī)到有機(jī)及生物活性物質(zhì)，以及熱穩(wěn)定到熱不穩(wěn)定的化合物，都可用色譜法分離。(3)選擇性強(qiáng)色譜分離有很強(qiáng)的選擇性,可通過多種途徑選擇不同的操作參數(shù)，以適應(yīng)各種不同樣品的分離要求。(4)高靈敏度的在線檢測(cè)(5)快速分離高效細(xì)顆粒固定相載體和高壓液相色譜分離技術(shù)的采用，保證在高分離效率前提下的高分離速率，可以提高單位時(shí)間的產(chǎn)量。(6)過程自動(dòng)化操作色譜/層析/色層機(jī)理：利用多組分

3、混合物中各組分物理、化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在固定相和流動(dòng)相中。當(dāng)多組分混合物隨流動(dòng)相流動(dòng)時(shí)，由于各組分物理、化學(xué)性質(zhì)的差別，而以不同的速率移動(dòng)，使之分離、純化。吸附色譜是指混合物隨流動(dòng)相通過固定相吸附劑時(shí)，由于固定相對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物分離。7.1.2色譜（Chromatography)分離的分類7.1.2.1按分離機(jī)理不同分類(一)吸附色譜分離(AdsorptionChromatography，AC)吸附色譜是各種色譜分離技術(shù)中應(yīng)用最早的一類，傳統(tǒng)吸附色譜以各種無機(jī)材料為吸附劑。新型吸附色譜技術(shù)，如疏水作用色譜、金屬整合作用色譜和共價(jià)作用色譜等。分

4、配色譜流動(dòng)相和固定相都是液體，利用混合物中各物質(zhì)在兩液相中的分配系數(shù)不同而分離。操作方法有兩種：一種是固定相是將與流動(dòng)相互不相溶的液體涂漬到載體上形成的；另一種是逆流分配法，固定相(重相)和流動(dòng)相(輕相)都放在一組特別的分配管中，用來完成這種操作的儀器稱為逆流分配儀。(二)分配色譜(DistributionChromatography，DC)離子交換色譜是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，由于混合物中不同溶質(zhì)對(duì)交換劑具有不同的結(jié)合力而將其分離。該法適合于離子和在溶劑中發(fā)生電離物質(zhì)的分離。離子交換色譜廣泛用于生物大分子分離純化，特別是在蛋

5、白質(zhì)、多肽、核酸等生物物質(zhì)的分離純化。(三)離子交換色譜(IonExchangeChromatography，IEC)(四)凝膠色譜(GelChromatography，GC)凝膠色譜以凝膠為固定相，是一種根據(jù)各物質(zhì)分子大小不同而進(jìn)行分離的色譜技術(shù)。凝膠色譜主要用于脫鹽、分級(jí)分離及分子量的測(cè)定。凝膠是不帶電荷的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，每個(gè)凝膠顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)就如一個(gè)篩子。混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)凝膠柱時(shí)，較大分子不能進(jìn)入所有的凝膠網(wǎng)孔而受到排阻，與流動(dòng)相一起首先流出；小分子能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，凝膠柱中流出次序靠后。生物體內(nèi)許多大分子化合物具有與其結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性(親和力)。把

6、與目的產(chǎn)物具有特異親和力的生物分子固定化后作為固定相，則當(dāng)含有目的產(chǎn)物的混合物(流動(dòng)相)流經(jīng)此固定相時(shí)，即可把目的產(chǎn)物從混合物中分離出來。(五)親和色譜(AffinityChromatography，AFC)廣泛用于定性與定量分析，不用于制備和生產(chǎn)。7.1.2.2按固定相形狀不同分類(1)柱色譜(2)紙上色譜進(jìn)樣量大，回收容易。除用于分析外，還廣泛用于生物樣品的制備和工業(yè)生物產(chǎn)品的分離與純化。(3)薄層色譜主要用于分析，也可用于小量樣品的制備。7.1.2.3其他分類方法(1)根據(jù)流動(dòng)相的物態(tài)分類氣相色譜、液相色譜和超臨界色譜(2)根據(jù)操作壓力分類低壓色譜(＜0.5MPa)、中壓

7、色譜(0.5～5MPa)和高壓色譜(5～50MPa)。(3)根據(jù)洗脫操作分類根據(jù)洗脫時(shí)展開方式的不同，可分為洗脫展開法、前沿分析法和置換展開法3種。色譜和電泳是目前最好的兩種分離方法，其塔板數(shù)可達(dá)百萬數(shù)量級(jí)。但電泳法目前尚不能用于生產(chǎn)規(guī)模的分離與純化，因而色譜技術(shù)成為分離和純化蛋白質(zhì)、酶、核酸、多糖等生物大分子物質(zhì)的核心手段。根據(jù)一次進(jìn)樣量的多少，色譜分離規(guī)?？煞譃椋悍治錾V：＜10mg半制備色譜：10～50mg制備色譜：0.1～10g工業(yè)色譜：＞20g／d7.1.3生物工業(yè)中的色譜分離(1