CASK基因在胰島β細(xì)胞特異性敲除小鼠的研究及其調(diào)控機(jī)制

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1、學(xué)校代碼：10286分類號：R587密級：公開UDC：616學(xué)號：152970CASK基因在胰島β細(xì)胞特異性敲除小鼠的研究及其調(diào)控機(jī)制研究生姓名：謝金陽導(dǎo)師姓名：王堯申請學(xué)位類別醫(yī)學(xué)碩士學(xué)位授予單位東南大學(xué)一級學(xué)科名稱臨床醫(yī)學(xué)論文答辯日期2018年5月30日二級學(xué)科名稱內(nèi)科學(xué)（內(nèi)分泌）學(xué)位授予日期2018年6月20日答辯委員會主席馬建華教授評閱人韓曉教授姚紅紅教授2018年6月4日碩士學(xué)位論文CASK基因在胰島β細(xì)胞特異性敲除小鼠的研究及其調(diào)控機(jī)制專業(yè)名稱：內(nèi)科學(xué)研究生姓名：謝金陽導(dǎo)師姓名：王堯Identificationandpheno

2、typeanalysisondisruptionofCASKgeneinmousepancreaticβcellsandtheregulationonCASKAThesisSubmittedtoSoutheastUniversityFortheAcademicDegreeofMasterofMedicalScienceSchoolofMedicineSoutheastUniversityMay2018東南大學(xué)學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注

3、和致謝的地方外，論文中不包含其他人己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得東南大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。／ｆ－：ｔ！研究生簽名．曰期：｝ｏ（ｈｆｐ東南大學(xué)學(xué)位論文使用授權(quán)聲明東南大學(xué)、中國科學(xué)技術(shù)信息研究所、國家圖書館、《中國學(xué)術(shù)期刊（光盤版）》電子雜志社有限公司、萬方數(shù)據(jù)電子出版社、北京萬方數(shù)據(jù)股份有限公司有權(quán)保留本人所送交學(xué)位論文的復(fù)印件和電子文檔，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。本人電子文

4、檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。除在保密期內(nèi)的保密論文外，允許論文被查閱和借閱，可以公布（包括以電子信息形式刊登）論文的全部內(nèi)容或中、英文摘要等部分內(nèi)容。論文的公布（包括以電子信息形式刊登）授權(quán)東南大學(xué)研究生院辦理。“■研究生簽名：食％師簽名：日期：＞／￥／部ｆ中文摘要CASK基因在胰島β細(xì)胞特異性敲除小鼠的研究及其調(diào)控機(jī)制東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院摘要第一章胰腺β細(xì)胞CASK基因特異性敲除小鼠制作鑒定及表型分析目的：糖尿病是一類以血糖升高為特征的代謝性疾病，由于胰島素分泌絕對或相對不足導(dǎo)致血糖升高，進(jìn)而誘發(fā)糖尿病。鈣/鈣調(diào)蛋白

5、依賴性絲氨酸蛋白激酶（calcium/calmodulin-dependentserineproteinkinase，CASK）在參與細(xì)胞內(nèi)外信號傳遞、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、離子通道的調(diào)節(jié)和突觸的信號傳遞等功能中發(fā)揮重要作用。我們前期的細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果顯示，CASK參與了胰島素囊泡的錨定環(huán)節(jié)。為了在小鼠水平研究CASK基因缺失對胰島素囊泡轉(zhuǎn)運的影響，本實驗擬建立胰島β細(xì)胞CASK基因特異性敲除的小鼠動物模型，初步完成鑒定及表型分析。方法：1.利用條件性基因打靶和染色體位點特異性重組酶Dre-Rox系統(tǒng)，借助于同源重組將兩個同向的lox

6、P位點置于CASK基因的編碼重要功能域外顯子6loxP/-loxP/Y兩側(cè)的內(nèi)含子序列中，從而獲得表型正常的CASK小鼠。2.利用CASK小鼠與MIP-Cre/ERT小鼠雜交后，tamoxifen誘導(dǎo)Cre酶進(jìn)入細(xì)胞核剪切l(wèi)oxP位點之間基因序列，得到胰島β細(xì)胞CASK特異性敲除小鼠。3.免疫熒光驗證CASK基因敲除效率。4.利用免疫熒光觀察胰島大小及胰島內(nèi)α細(xì)胞和β細(xì)胞分布。loxP/-結(jié)果：1、SouthernBlot顯示CASK小鼠基因標(biāo)記位置正確；2、免疫熒光顯示，CASK在胰腺各種細(xì)胞中均有表達(dá)，敲除小鼠胰島β細(xì)胞中CASK的蛋

7、白表達(dá)下降；3、特異性敲除小鼠胰島β細(xì)胞CASK對胰島內(nèi)α細(xì)胞和β細(xì)胞分布無明顯差異。結(jié)論：成功制備胰島β細(xì)胞特異性CASK基因敲除小鼠，尚未發(fā)現(xiàn)明顯表型的異常。關(guān)鍵詞：CASK；條件性敲除；胰島素分泌；胰島β細(xì)胞第二章轉(zhuǎn)錄因子PPARγ對CASK的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用目的：探討轉(zhuǎn)錄因子PPARγ對CASK的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。方法：用不同濃度羅格列酮處理胰島β細(xì)胞系INS-1細(xì)胞觀察胰島素分泌的變化；用不同濃度及不同時間羅格列酮處理INS-1細(xì)胞，利用定量PCR、westernblot、免疫熒光檢測CASK的表達(dá)變化；染色質(zhì)免疫共沉淀尋找轉(zhuǎn)錄因子PP

8、ARγ在CASK啟動子區(qū)域結(jié)合位點；利用PPARγ特異性干擾片段預(yù)處理INS-1細(xì)胞后觀察羅格列酮對CASK的影響；觀察干擾CASK后對羅格列酮刺激的胰島素分泌有無影響。I東南大學(xué)碩士學(xué)位論文