乙酰化修飾調(diào)控家蠶BmApoLp-Ⅲ蛋白穩(wěn)定性的研究

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1、ZSTUZhejiangSci-TechUniversity碩士學(xué)位論文Master’sThesis中文論文題目:乙?；揎椪{(diào)控家蠶BmApoLp-Ⅲ蛋白穩(wěn)定性的研究英文論文題目：ThestudyonthestabilityofBmApoLp-IIIregulatedbyacetylationmodificationinBombyxmori學(xué)科專業(yè)：生物學(xué)作者姓名：朱兵指導(dǎo)教師：聶作明副教授遞交日期：2018-04-19浙江理工大學(xué)學(xué)位論文獨立性聲明本人聲明所提交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作。除了文中特，表加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人

2、已經(jīng)發(fā)表或者撰寫過的科研成果也不包含為獲得浙江理工大學(xué)或者其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或者證書而使用過的材料。對本課題有貢獻(xiàn)的其他人士均己在論文中做了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：簽字口期：屮／祥／月丨日Ｉ學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解浙江理工大學(xué)有權(quán)保留并向相關(guān)國家部門或機(jī)構(gòu)送交本論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)浙江理工大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部內(nèi)容或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索和傳播，可以采用影印、縮印成掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。（保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書）學(xué)位論文作者簽名：簽

3、字日期：屮Ｕ年／月丨日Ｉ導(dǎo)師簽名：簽字日期丨：屮眸／月日丨丨浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文乙酰化修飾調(diào)控家蠶BmApoLp-Ⅲ蛋白穩(wěn)定性的研究摘要Apolipophorin-Ⅲ（ApoLp-Ⅲ）是存在于昆蟲血淋巴中的一種轉(zhuǎn)運脂肪的營養(yǎng)儲藏類蛋白，其屬于載脂蛋白家族，在脂肪體中合成，主要用于脂質(zhì)的儲藏和轉(zhuǎn)運，在免疫反應(yīng)、炎癥的發(fā)生及抵抗外部細(xì)菌的侵染等方面也起著重要的作用。乙?；揎検且环N重要的可逆蛋白翻譯后修飾，可以調(diào)控蛋白與DNA的互作、基因轉(zhuǎn)錄、應(yīng)激反應(yīng)、新陳代謝和蛋白穩(wěn)定性等，與糖尿病、癌癥和心血管病等多種重大疾病有關(guān)聯(lián)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，家蠶血淋巴中包括Apo

4、Lp-Ⅲ（BmApoLp-Ⅲ）的多種營養(yǎng)儲藏類蛋白存在大量乙?；揎椢稽c，其中乙?；揎椏梢哉{(diào)控其中的SP2和30K-3蛋白的穩(wěn)定性?；谇捌谘芯?，本課題同樣開展乙?；揎椪{(diào)控家蠶BmApoLp-Ⅲ穩(wěn)定性的功能研究，為進(jìn)一步深入研究乙酰化調(diào)控家蠶營養(yǎng)儲藏和利用的機(jī)制打下基礎(chǔ)。首先利用RT-PCR的方法從家蠶卵巢細(xì)胞總RNA中獲得了BmApoLp-Ⅲ基因的編碼區(qū)片段（ORF），將其克隆至改造后的真核表達(dá)載體pIEX-1-si-GFP中，獲得了重組真核表達(dá)載體pIEX-1-si-GFP-ApoLp-Ⅲ。轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，成功表達(dá)出HIS融合的BmApoLp-Ⅲ重組蛋白。利用H

5、IS單抗免疫共沉淀獲得純化的BmApoLp-Ⅲ蛋白，乙?；瘑慰惯M(jìn)行Westernblotting檢測，結(jié)果表明BmApoLp-Ⅲ存在高度的乙?；揎棧颓捌谫|(zhì)譜鑒定結(jié)果一致。其次，我們采用去乙?；敢种苿㎜BH589和乙?；敢种苿〤646分別上調(diào)和下調(diào)蛋白的乙酰化水平，結(jié)果顯示，LBH589和C646處理后，BmApoLp-Ⅲ蛋白的表達(dá)量分別呈現(xiàn)為上調(diào)和下調(diào)的趨勢，并且在轉(zhuǎn)錄水平上并無影響，這一結(jié)果表明，乙酰化修飾可以在翻譯后水平影響B(tài)mApoLp-Ⅲ蛋白的表達(dá)和細(xì)胞含量。利用CHX和MG132處理細(xì)胞，研究乙酰化修飾對蛋白的降解和積累的影響，結(jié)果表明，CHX阻斷蛋白合成

6、途徑后，與對照組相比，乙酰化水平上調(diào)可以明顯減緩BmApoLp-Ⅲ蛋白的降解，反之，MG132阻斷蛋白降解途徑后，乙酰化水平的上調(diào)可進(jìn)一步提高BmApoLp-Ⅲ蛋白的細(xì)胞含量，上述結(jié)果表明乙?；降纳险{(diào)可以提高BmApoLp-Ⅲ的穩(wěn)定性。最后開展BmApoLp-Ⅲ蛋白乙?；c泛素化競爭實驗，結(jié)果表明，當(dāng)BmApoLp-Ⅲ乙?；教岣吆?，其泛素化水平I浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文乙?；揎椪{(diào)控家蠶BmApoLp-Ⅲ蛋白穩(wěn)定性的研究降低，反之亦然，乙?；头核鼗匠守?fù)相關(guān)結(jié)果，推測BmApoLp-Ⅲ的乙酰化與泛素化存在競爭關(guān)系。綜合上述結(jié)果表明，乙?；揎椏梢栽诜g后水平上調(diào)

7、BmApoLp-Ⅲ的蛋白表達(dá)和穩(wěn)定性，其分子機(jī)制可能是通過競爭其泛素化修飾，阻滯泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解途徑，從而提高蛋白的穩(wěn)定性和細(xì)胞含量。上述結(jié)果有望發(fā)現(xiàn)家蠶中一種新的調(diào)控載脂蛋白穩(wěn)定性和水解的新機(jī)制。另外，我們利用H2O2誘導(dǎo)BmN細(xì)胞凋亡，證實BmApoLp-Ⅲ蛋白具有劑量依賴的抗細(xì)胞調(diào)亡能力，同時LBH589處理細(xì)胞后可以進(jìn)一步顯著提高細(xì)胞的成活率，而C646卻使細(xì)胞的成活率顯著下降，表明乙?；揎椏梢蕴岣連mApoLp-Ⅲ蛋白的抗細(xì)胞調(diào)亡能力。綜合前面的研究結(jié)果，推測其機(jī)制可能是乙?；降纳险{(diào)提高了Bm