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《IL-15對調節(jié)性T細胞自噬作用影響的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、單位代碼10602學號2015011133分類號R34密級公開碩士學位論文IL-15對調節(jié)性T細胞自噬作用影響的研究TheeffectandmechanismofIL-15onautophagyinregulatoryTcells學院：生命科學學院學科名稱：生物學研究方向：生物化學與分子生物學年級：2015級研究生：李佳童亞林教授指導教師：姚詠明教授完成日期：2018年6月IL-15對調節(jié)性T細胞自噬作用影響的研究專業(yè)名稱：生物學申請人：李佳指導教師：童亞林教授姚詠明教授IL-15對調節(jié)性T細胞自噬作用影響的研究研究生:李佳年級:2015級導師：童亞林教授姚詠明教授學科專業(yè)：生物學研究方向
2、：生物化學與分子生物學中文摘要研究目的本實驗利用BALB/c小鼠的調節(jié)性T細胞（Treg），研究在不同劑量、不同時間IL-15作用下，細胞發(fā)生自噬的情況以及免疫功能的變化。明確IL-15對Treg自噬作用和免疫功能影響。進一步利用IL-15、自噬抑制劑SBI-0206965或自噬誘導劑雷帕霉素（Rapamycin,Rap）處理細胞，探索IL-15通過調節(jié)Treg細胞自噬影響其功能的相關分子機制。研究方法1、取BALB/c小鼠脾臟，通過MiniMACs免疫磁性分離系統(tǒng)從單個核細胞中分離CD4+CD25+Treg細胞和CD4+CD25-T細胞（效應性T細胞，Teff）。利用流式細胞技術對細胞進
3、行純度鑒定和活力檢測。2、IL-15對Treg細胞相關分子Foxp3和CTLA-4表達的影響：將分離出的Treg細胞計數(shù)，以2×105個/孔接種于96孔板。按照IL-15濃度分為10ng/ml組、25ng/ml組、50ng/ml組和100ng/ml組；按照培養(yǎng)時間分組，分為12h組、24h組、48h組和72h組。分別給予相應劑量和IL-15處理相應時間，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。分別收集細胞后，采用流式細胞術檢測Foxp3和CTLA-4表達水平。3、IL-15對Treg細胞自噬的相關分子LC3的影響：選取IL-15對Treg細胞活化影響的最佳劑量和時間條件。將分離出的Treg細
4、胞計數(shù)，以2×105個/孔接種于96孔板。對細胞進行分組：Control組、IL-15組、SBI組、IL-15+SBI組、Rap組、IL-15+Rap組。此外，為模擬膿毒癥體外環(huán)境加入LPS，進行同樣的分組。分別給予相應的試劑處理后，對細胞進行免疫熒光染色，共聚焦觀察LC3的表達，研究Treg細胞內自噬體的形成情況。并收集細胞，利用流式細胞術檢測LC3分子表達水平。4、IL-15和細胞自噬對Treg細胞相關分子Foxp3和CTLA-4表達的影響：將分離I出的Treg細胞計數(shù)，以2×105個/孔接種于96孔板。對細胞進行分組：Control組、IL-15組、SBI組、IL-15+SBI組、R
5、ap組、IL-15+Rap組。此外，為模擬膿毒癥體外環(huán)境加入LPS，進行同樣的分組。收集細胞后，F(xiàn)oxp3和CTLA-4分子進行流式細胞術檢測其表達水平。5、IL-15對Treg細胞免疫功能的影響：采用ELISA法檢測各個分組上清液中IL-10和TGF-β水平的變化。并將Treg和Teff進行共培養(yǎng)后，檢測上清液中IL-2、IFN-γ和IL-4的分泌水平。研究結果1、按上述步驟從BALB/c小鼠單個核細胞中分選出CD4+CD25+Treg細胞后檢測其純度達到92%以上，Teff細胞的純度為95%，苔盼藍檢測到CD4+CD25+Treg的活性均在94%以上。2、IL-15在劑量為100ng/
6、ml處理48h的條件下，Treg細胞表面分子Foxp3和CTLA-4的表達水平顯著增加（P<0.01），在此情況下，IL-15對Treg細胞刺激最為明顯。因此選定該條件處理后續(xù)實驗。3、共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光和流式細胞術分析結果均顯示，相較于Control組，IL-15組和SBI組LC3分子表達水平顯著減少，IL-15+SBI組明顯增加（P<0.05），Rap組和IL-15+Rap組顯著上調（P<0.01）。在LPS刺激Treg細胞條件下，較Control組，IL-15組和SBI組的LC3分子表達水平顯著下調，IL-15+SBI組明顯增加（P<0.05），Rap組和IL-15+Rap組顯
7、著增強（P<0.01）。4、流式細胞分析結果顯示：相較于Control組，IL-15組和IL-15+Rap組細胞Foxp3表達顯著上調（P<0.01），IL-15+SBI組和Rap組細胞Foxp3和CTLA-4表達均有增加（P<0.05）。在LPS刺激Treg細胞條件下，IL-15+Rap組細胞Foxp3和CTLA-4表達水平在比Control組顯著增多（P<0.01）。5、采用ELISA技術檢測各個組細胞培養(yǎng)上清液中細
