抗原特異性調(diào)節(jié)性T細胞的培養(yǎng)擴增

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1、分類號：R657．3密級：學位類別：科學學位團專業(yè)學位口學校代碼：1062學號；2010602651學科門類：醫(yī)學又滓眚科鼻辱碩士學位論文MASTER’SDISSERTATIoN論文題目：抗原特異性調(diào)節(jié)性T細胞的培養(yǎng)擴增TITLETheCultivationandAmplificationofAntigen-specificRegulatoryTCells一級學科：臨床醫(yī)學二級學科：外科學普外論文作者：王永磊指導教師：朱志軍教授天津醫(yī)科大學研究生院二。一三年五月學位論文原創(chuàng)性聲明I㈣L———————————————————一本人鄭重聲明：所呈交的論文是我個人在導師指導下獨立進行研究工作

2、取得的研究成果。除了文中特別加以標注引用的內(nèi)容和致謝的地方外，論文中不包含任何其他個人或集體己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。學位論文作者簽名：_乏壘趁日期：砂}k多廳√掃學位論文版權使用授權書本學位論文作者完全了解天津醫(yī)科大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權將學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，并采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編以供查閱和借閱。同意學校向國家有關部門或機構送交論文，并編入有關數(shù)據(jù)庫。保密口，在——年解密后適用本授權書。本論文屬于不保密團。(請在相對應的方框內(nèi)打“√”

3、)學位論文作者簽名導師簽名天津醫(yī)科大學碩士學位論文中文摘要【目的】培養(yǎng)擴增出抗原特異性CD4+CD25+Treg細胞，并觀察其免疫抑制功能，為今后臨床利用抗原特異性CD4+CD25+Treg細胞誘導器官移植免疫耐受提供新思路。I：；b-法】本實驗分兩部分：第一部分，提取小鼠脾臟CD4+CD25+Treg細胞：利用免疫磁珠分選系統(tǒng)分選Balb／c小鼠脾臟的CD4+CD25+Treg細胞，包括陰性分選獲得CD4+T細胞，陽性分選獲得CD4+CD25+Treg細胞。并用流式細胞儀檢測分選后細胞的純度及Foxp3表達率。第二部分，培養(yǎng)擴增抗原特異性CD4+CD25+Treg細胞：①提取C57小

4、鼠脾細胞，經(jīng)絲裂霉素C滅活后與提取的Balb／c小鼠CD4+CD25+Treg細胞(10：1)于96孔培養(yǎng)板中混合培養(yǎng)，培養(yǎng)基選用RPMll640完全培養(yǎng)基，配以10％胎牛血清、rmlL一22000U／mL、雷帕霉素100nmol／mL，37。C、5％C02、100％濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天，第3、5、7、9、ll天換液，第14天收集細胞；②T細胞增殖抑制實驗，檢測培養(yǎng)后CD4+CD25+Treg的抗原特異性。實驗分成四組：第一組(實驗組)：C57小鼠CD4+CD25一T細胞+培養(yǎng)后的Balb／c小鼠CD4+CD25+Treg+C57小鼠脾細胞；第二組(對照組)：C57小鼠CD4+CD2

5、5。T細胞十未培養(yǎng)的Balb／c小鼠CD4+CD25+Treg+C57小鼠脾細胞；第三組(空白對照組)：C57小鼠CD4+CD25。T細胞+C57小鼠脾細胞；第四組(第三方對照組)：昆明小鼠CD4+CD25’T細胞+培養(yǎng)后的Balb／c小鼠CD4+CD25+Treg+C57小鼠脾細胞。通過觀察比較各組CD4+CD25+T細胞增殖情況的不同判斷擴增出來的CD4+CD25+Treg是否有抗原特異性。⑧不同濃度CD4+CD25+Treg對T細胞的增殖抑制試驗：將培養(yǎng)后的Balb／c小鼠CD4+CD25+Treg與C57小鼠CD4+CD25。T細胞分別按0．5：l、1：1、2．1、4：1、8：

6、1混合培養(yǎng)，觀察各孔中CD4+CD25"F細胞的增殖情況。④數(shù)據(jù)用統(tǒng)計軟件SPSSl4．0軟件進行統(tǒng)計學處理。正態(tài)分布的變量，兩組之問比較采用獨立樣本f檢驗；非正態(tài)分布變量比較采用秩和檢驗。檢驗水準0【=0．05。【結果】第一部分：利用免疫磁珠分選系統(tǒng)，經(jīng)陰性分選及陽性分選，可分選出純度達90％的CD4+CD25+Treg細胞，F(xiàn)oxp3表達率達95％以上，其分離方法穩(wěn)定、高效，可用于進行相關研究。天津醫(yī)科大學碩士學位論文第二部分：’1．C57小鼠特異性CD4+CD25+Treg細胞的培養(yǎng)擴增：Balb／c小鼠CD4+CD25+Treg細胞加入C57小鼠脾細胞(1：10)，經(jīng)過14天培

7、養(yǎng)后，Balb／e小鼠CD4+CD25+Treg細胞約擴增10倍。2．T細胞增殖抑制試驗：各組培養(yǎng)72小時后，流式細胞檢測結果顯示：①實驗組中C57小鼠原代CD4+CD25。T細胞比例明顯比對照組中的高(86．0％±3．9％VS．40．6％±1．9％，P<0．05)，因此利用C57小鼠脾細胞擴增出的Balb／c小鼠CD4+CD25+Treg細胞比新鮮提取的Balb／c小鼠CD4+CD25+Treg細胞對C57小鼠CD4+CD25‘T細胞抑制作用