基因敲除小鼠技術專題

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1、轉基因、基因敲入/敲除動物技術已經成為現(xiàn)代生命科學基礎研究和藥物研發(fā)領域不可或缺的重要技術，該技術從上世紀七八十年代誕生以來，已有近四十年的歷史，經典技術如DNA原核顯微注射、胚胎干細胞顯微注射技術一直以來經久不衰，并逐漸從基礎研究實驗室轉向商業(yè)模式，成為一項高度標準化的新興產業(yè)。轉基因、基因敲入/敲除動物技術已經成為現(xiàn)代生命科學基礎研究和藥物研發(fā)領域不可或缺的重要技術，該技術從上世紀七八十年代誕生以來，至今已有近四十年的歷史，經典技術如DNA原核顯微注射、胚胎干細胞顯微注射技術一直以來經久不衰，在小鼠模型構建方面日趨完善，并且如同剪切酶和抗體等常規(guī)分子生物學試劑的制備技術一樣，逐漸

2、從基礎研究實驗室轉向商業(yè)模式，成為一項高度標準化的新興產業(yè)，催生了數(shù)以百計的創(chuàng)新藥物和數(shù)以千計的優(yōu)秀文章。盡管如此，傳統(tǒng)技術仍然存在一些難以克服的缺陷，如步驟繁瑣、周期漫長、成功率低、費用高昂等，而ZFN和TALEN等新技術的出現(xiàn)，或有可能將這一局面徹底改變。基因敲除鼠技術是上世紀80年代中后期基于DNA同源重組的原理發(fā)展起來的，Capecchi和Smithies在1987年根據(jù)同源重組（homologousrecombination）的原理，首次實現(xiàn)了ES的外源基因的定點整合（targetedintegration），這一技術稱為"基因打靶"（genetarge

3、ting）或"基因敲除"（geneknockout），利用這種ES的顯微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KOMice:knockoutmice）;由于這一工作，Capecchi和Smithies于2007年與Evans分享了諾貝爾醫(yī)學獎。同源重組（homologousrecombination）定義：是指發(fā)生在姐妹染色單體（sisterchromatin)之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內的重新組合。在基因敲除小鼠制作過程中，需要針對目的基因兩端特異性片段設計帶有相同片段的重組載體，將重組載體導入到胚胎干細胞后外源的重組載體與胚胎干細胞中相同的

4、片段會發(fā)生同源重組，如圖1所示：圖2.基因敲除鼠制作過程示意圖1、Knockout載體設計與構建根據(jù)研究項目具體情況和要求把目的基因和與細胞內靶基因特異片段同源的DNA片段都重組到帶有標記基因(如neo基因，TK基因等)的載體上，成為重組的Knockout載體。2、KnockoutES細胞篩選Knockout載體測序驗證正確后，將載體線性化，然后電轉入ES細胞，通過載體上的正負篩選基因獲得陽性的KnockoutES克隆。選取PCR鑒定打靶載體正確插入的ES基因組DNA用于SouthernBlot鑒定，將SouthernBlot鑒定的KnockoutES擴大培養(yǎng)并液氮保存。

5、3、KnockoutES細胞囊胚注射得到嵌合體小鼠擴增經鑒定插入或置換片段位置正確的KnockoutES細胞，以囊胚顯微注射的方式將一定數(shù)量的KnockoutES細胞注入特定品系小鼠囊胚中，然后將囊胚移植到假孕的小鼠子宮中。待后代小鼠出生后，通過小鼠的毛色中來源于ES細胞毛色的比例判斷嵌合程度的高低，以及該小鼠的后代中可能獲得生殖系傳遞能力。4、由嵌合體小鼠繁殖出生殖遺傳系Knockout小鼠將嵌合體小鼠與適當品系的小鼠交配，后代小鼠出生后，通過PCR方式檢測小鼠是否含有打靶序列。如有，則該小鼠為具備生殖遺傳能力的Knockout小鼠(F1代鼠)。5、Knockout小鼠生殖

6、系傳遞鑒定將嵌合體小鼠和適當品系野生型小鼠交配，通過后代小鼠毛色或PCR基因型鑒定的方法驗證嵌合體小鼠生殖系傳遞能力。常規(guī)基因敲除是通過基因打靶，把需要敲除的基因的幾個重要的外顯子或者功能區(qū)域用NeoCassette替換掉。這樣的小鼠其全身所有的組織和細胞中都不表達該基因產物。此類基因敲除鼠一般用于研究某個基因在對小鼠全身生理病理的影響，而且這個基因沒有胚胎致死性。二、條件性基因敲除小鼠（ConditionalKnockout）條件性基因敲除小鼠是通過基因打靶，把兩個loxP位點放到目的基因一個或幾個重要的外顯子的兩邊。該小鼠和表達Cre酶小鼠雜交之前，其目的基因表達完全正

7、常。當和組織特異性表達Cre酶的小鼠進行雜交后，可以在特定的組織或細胞中敲除該基因，而該基因在其他組織或細胞表達正常。條件性基因敲除鼠適用范圍為：（1）該基因有胚胎致死性；（2）用于研究該基因在特定的組織或細胞中的生理病理功能。三、基因敲入小鼠（Knockin）一、ZFN技術制作基因敲除鼠ZFN能夠識別并結合指定的基因序列位點，并高效精確地切斷。隨后細胞利用天然的DNA修復過程來實現(xiàn)DNA的插入、刪除和修改，這樣研究人員就能夠隨心所欲