基因敲除小鼠技術(shù)專題

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1、轉(zhuǎn)基因、基因敲入/敲除動(dòng)物技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)領(lǐng)域不可或缺的重要技術(shù)，該技術(shù)從上世紀(jì)七八十年代誕生以來，已有近四十年的歷史，經(jīng)典技術(shù)如DNA原核顯微注射、胚胎干細(xì)胞顯微注射技術(shù)一直以來經(jīng)久不衰，并逐漸從基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)向商業(yè)模式，成為一項(xiàng)高度標(biāo)準(zhǔn)化的新興產(chǎn)業(yè)。轉(zhuǎn)基因、基因敲入/敲除動(dòng)物技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)領(lǐng)域不可或缺的重要技術(shù)，該技術(shù)從上世紀(jì)七八十年代誕生以來，至今已有近四十年的歷史，經(jīng)典技術(shù)如DNA原核顯微注射、胚胎干細(xì)胞顯微注射技術(shù)一直以來經(jīng)久不衰，在小鼠模型構(gòu)建方面日趨完善，并且如同剪切酶和抗體等常規(guī)分子生物學(xué)試劑的制備技術(shù)一樣，逐漸

2、從基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)向商業(yè)模式，成為一項(xiàng)高度標(biāo)準(zhǔn)化的新興產(chǎn)業(yè)，催生了數(shù)以百計(jì)的創(chuàng)新藥物和數(shù)以千計(jì)的優(yōu)秀文章。盡管如此，傳統(tǒng)技術(shù)仍然存在一些難以克服的缺陷，如步驟繁瑣、周期漫長、成功率低、費(fèi)用高昂等，而ZFN和TALEN等新技術(shù)的出現(xiàn)，或有可能將這一局面徹底改變。基因敲除鼠技術(shù)是上世紀(jì)80年代中后期基于DNA同源重組的原理發(fā)展起來的，Capecchi和Smithies在1987年根據(jù)同源重組（homologousrecombination）的原理，首次實(shí)現(xiàn)了ES的外源基因的定點(diǎn)整合（targetedintegration），這一技術(shù)稱為"基因打靶"（genetarge

3、ting）或"基因敲除"（geneknockout），利用這種ES的顯微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KOMice:knockoutmice）;由于這一工作，Capecchi和Smithies于2007年與Evans分享了諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。同源重組（homologousrecombination）定義：是指發(fā)生在姐妹染色單體（sisterchromatin)之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重新組合。在基因敲除小鼠制作過程中，需要針對目的基因兩端特異性片段設(shè)計(jì)帶有相同片段的重組載體，將重組載體導(dǎo)入到胚胎干細(xì)胞后外源的重組載體與胚胎干細(xì)胞中相同的

4、片段會(huì)發(fā)生同源重組，如圖1所示：圖2.基因敲除鼠制作過程示意圖1、Knockout載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建根據(jù)研究項(xiàng)目具體情況和要求把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA片段都重組到帶有標(biāo)記基因(如neo基因，TK基因等)的載體上，成為重組的Knockout載體。2、KnockoutES細(xì)胞篩選Knockout載體測序驗(yàn)證正確后，將載體線性化，然后電轉(zhuǎn)入ES細(xì)胞，通過載體上的正負(fù)篩選基因獲得陽性的KnockoutES克隆。選取PCR鑒定打靶載體正確插入的ES基因組DNA用于SouthernBlot鑒定，將SouthernBlot鑒定的KnockoutES擴(kuò)大培養(yǎng)并液氮保存。

5、3、KnockoutES細(xì)胞囊胚注射得到嵌合體小鼠擴(kuò)增經(jīng)鑒定插入或置換片段位置正確的KnockoutES細(xì)胞，以囊胚顯微注射的方式將一定數(shù)量的KnockoutES細(xì)胞注入特定品系小鼠囊胚中，然后將囊胚移植到假孕的小鼠子宮中。待后代小鼠出生后，通過小鼠的毛色中來源于ES細(xì)胞毛色的比例判斷嵌合程度的高低，以及該小鼠的后代中可能獲得生殖系傳遞能力。4、由嵌合體小鼠繁殖出生殖遺傳系Knockout小鼠將嵌合體小鼠與適當(dāng)品系的小鼠交配，后代小鼠出生后，通過PCR方式檢測小鼠是否含有打靶序列。如有，則該小鼠為具備生殖遺傳能力的Knockout小鼠(F1代鼠)。5、Knockout小鼠生殖

6、系傳遞鑒定將嵌合體小鼠和適當(dāng)品系野生型小鼠交配，通過后代小鼠毛色或PCR基因型鑒定的方法驗(yàn)證嵌合體小鼠生殖系傳遞能力。常規(guī)基因敲除是通過基因打靶，把需要敲除的基因的幾個(gè)重要的外顯子或者功能區(qū)域用NeoCassette替換掉。這樣的小鼠其全身所有的組織和細(xì)胞中都不表達(dá)該基因產(chǎn)物。此類基因敲除鼠一般用于研究某個(gè)基因在對小鼠全身生理病理的影響，而且這個(gè)基因沒有胚胎致死性。二、條件性基因敲除小鼠（ConditionalKnockout）條件性基因敲除小鼠是通過基因打靶，把兩個(gè)loxP位點(diǎn)放到目的基因一個(gè)或幾個(gè)重要的外顯子的兩邊。該小鼠和表達(dá)Cre酶小鼠雜交之前，其目的基因表達(dá)完全正

7、常。當(dāng)和組織特異性表達(dá)Cre酶的小鼠進(jìn)行雜交后，可以在特定的組織或細(xì)胞中敲除該基因，而該基因在其他組織或細(xì)胞表達(dá)正常。條件性基因敲除鼠適用范圍為：（1）該基因有胚胎致死性；（2）用于研究該基因在特定的組織或細(xì)胞中的生理病理功能。三、基因敲入小鼠（Knockin）一、ZFN技術(shù)制作基因敲除鼠ZFN能夠識(shí)別并結(jié)合指定的基因序列位點(diǎn)，并高效精確地切斷。隨后細(xì)胞利用天然的DNA修復(fù)過程來實(shí)現(xiàn)DNA的插入、刪除和修改，這樣研究人員就能夠隨心所欲