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1、上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司SIDANSAIBiotechnologyCO.,LTD小鼠：分類：小鼠屬于哺乳綱（Mammalia）、嚙齒目（Rodentia）、鼠科（Muridae）、小鼠屬（Mus）動物。特征：生長期短、成熟早、繁殖力強。性成熟：6~7周。雌性35～50日齡，雄性45～60日齡；體成熟：雌性為65～75日齡，雄性為70～80日齡；性周期為4～5天，妊娠期為19～21天；哺乳期為20～22天；一次排卵10～23個（視品種而定），每胎產(chǎn)仔數(shù)為8～15只，一年產(chǎn)仔胎數(shù)6～10胎，屬全年、多發(fā)情性動物，繁殖率很高，生育期為一年。確定靶基因
2、同源重組介導(dǎo)的小構(gòu)建同源重組載體鼠基因打靶流程載體線性化導(dǎo)入ES篩選同源重組成功的ESES顯微注射囊胚野生型F0代（嵌合體）野生型野生型F1代（雜合體）F1代（雜合體）野生型F2代（雜合體）F2代（純合體）確定靶基因TALEN介導(dǎo)的小構(gòu)建TALEN載體鼠基因打靶流程TALEN活性檢測小鼠3T3細胞體外轉(zhuǎn)錄mRNA注：KI加同源載體DonorDNA將mRNA注射入一細胞期受精卵野生型F0代（嵌合體）野生型野生型F1代（雜合體）F1代（雜合體）野生型F2代（雜合體）F2代（純合體）Step1設(shè)計TALEN打靶載體?針對靶基因的兩個不同位點分別設(shè)計一個
3、2X3的TALEN組合5’3’3’5’Spacer12-21bpStep2構(gòu)建TALEN打靶載體?通過FastTALETM一步連接法完成TALEN載體的構(gòu)建上游引物測序結(jié)果比對下游引物測序結(jié)果比對Step3細胞水平TALEN活性驗證Day1:小鼠3T3細胞鋪板篩選出一對高活性的TALEN質(zhì)粒用于后續(xù)實驗Day2：Fugene共轉(zhuǎn)TALEN左右臂質(zhì)粒和EIP質(zhì)粒①PCR產(chǎn)物測序結(jié)果②PCR產(chǎn)物進行TA克隆查看套峰測序，計算突變率Day3:藥物篩選（puromycin,1μg/ml）Day6:收集剩余細胞,PCR靶向序列片段，抽基因組DNA擴增出50
4、0bp左右在靶位點上下游設(shè)計PCR引物，對打靶后的細胞基因組DNA進行PCRPCR-FTALEN-L>200bp>200bpTALEN-RPCR-RMarker560bp目的基因片段PCR擴增活性檢測方法①：PCR產(chǎn)物測序結(jié)果查看峰圖方法：TALEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞藥物篩選，收集細胞提取基因組DNAPCR擴增PCR產(chǎn)物測序打靶效率中等的樣品活性檢測方法②：PCR產(chǎn)物連T載體，單克隆測序計算突變率?挑取30-50個克隆，將測序結(jié)果與目標基因的原始系列進行比對，計算突變率。注：圖中第一排WT為原始序列，---表示缺失，紅色為插入或置換。Step4體外轉(zhuǎn)錄
5、生成mRNATALEN質(zhì)粒線性化根據(jù)載體所帶啟動子選擇相應(yīng)試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄mRNA濃度、純度檢測原核啟動子：sp6或T7mRNA轉(zhuǎn)錄后的大小檢測：若片段大于1.5kb可用瓊脂糖凝膠電泳檢測；若片段較小，建議用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。Step5胚胎注射mRNATALEN左右臂注射至一細胞移至代孕雌鼠37℃培養(yǎng)24hmRNA按1:1期受精卵中，至小鼠至二細胞期比例混合細胞質(zhì)中出生（3周）注射濃度300-500ng/ul注射體積：5-15plStep6F0代突變體小鼠檢測T7E1酶切鑒定法：F0代小鼠剪尾，抽提基因組DNA剪小鼠的尾巴或腳趾提取基因組
6、DNAPCR靶向基因序列PCR擴增靶基因位點PCR產(chǎn)物于94℃失活、50-60℃退火T7E1酶切鑒定PCRT7E1酶37℃作用1h產(chǎn)物，進行初步篩選瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物連TA克隆進行測序，進一步確認F0代突變體小鼠Step7獲得F1代雜合體小鼠F0代突變體小鼠x野生型小鼠F1代雜合子小鼠F1代小鼠剪尾，抽提基因組DNAPCR靶向基因序列通過PCR產(chǎn)物測序查看峰圖及TA克隆測序結(jié)果比對，鑒定F1代雜合體小鼠同源重組介導(dǎo)的knockoutTALEN介導(dǎo)的knockoutanimalmodelanimalmodel經(jīng)由ES，同源重組打靶得到Kn
7、ockout無需經(jīng)過ES階段，直接注射到胚胎ES細胞系后，再注射到囊胚進行打靶打靶效率高打靶效率低TALEs特異性識別DNA堿基序列，F(xiàn)ok1切斷雙鏈DNA從而造成雙鏈斷裂細胞內(nèi)自然發(fā)生的同源染色體隨機交換，(DSB)，引入的DSB激活的DNA自我修復(fù)引起基因的突變和促進靶位點DNA打靶效率通常只有10-6至10-8同源重組。外源引發(fā)DNA斷裂，幾率高，提高幾百倍甚至千倍knockout不需要同源序列同源臂很長，一般3-5kb,克隆困難knockin同源序列1k以內(nèi)，易于克隆周期長：12-18個月周期短：6-10個月成本高：12萬成本低：10萬S
8、IDANSAIBiotechnologyCO.,LTDwww.sidansai.com
