石榴果皮褐變實(shí)驗(yàn)方案16-2-23

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1、果皮褐變指數(shù)果皮失重率和平均散失速率的測定失重率采用稱量法，每個(gè)樣品50g,重復(fù)稱量3次，取其平均值。失重率（%）=（不同時(shí)間樣品質(zhì)量-樣品初質(zhì)量）/樣品初質(zhì)量×100%平均散失速率（%/d）=失重率/存放時(shí)間；其中%為散失百分率；d為存放時(shí)間（d）1.‘玉石籽’褐變過程中酶促褐變相關(guān)酶活性的變化褐變過程中PPO，POD等活性變化。（1）PPO酶活性測定方法①石榴果皮PPO酶液的提取取石榴果皮0.5g，置于研缽中，加入5mL4℃下預(yù)冷的pH7.0的磷酸緩沖液（含1%聚乙烯吡咯烷酮和10mmol/L的抗壞血酸）和少量石英砂，冰浴研磨成勻漿，4℃下12000r.min-1離心20min

2、,上清液即為PPO和POD粗提液，4℃保存?zhèn)溆?。②PPO活性測定參考張立華等（2007）的方法并改進(jìn)，向反應(yīng)管中加入2.95ml(鄰苯二酚，濃度為0.2mol/L)，于25℃水浴中平衡3min，取出試管，向其加中加50μL粗酶提取液（以煮過失活的酶液為對(duì)照），使用410nm波長處進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)分析，立即計(jì)時(shí)，掃描隨后2min內(nèi)溶液在410nm處的吸光度變化，每30s讀數(shù)一次，共記錄5次，然后以每分鐘內(nèi)A410變化0.01為一個(gè)酶活性單位(U)。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，取其平均值。③PPO活性計(jì)算公式:（2）果皮過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法。POD活性測定參考印芳等(2

3、008)的方法并改進(jìn)：取上述粗酶液50μL與2.95mLPOD反應(yīng)液(0.125mL愈創(chuàng)木酚+0.255mL30%H2O2，用pH7.0磷酸緩沖液稀釋至250mL)，使用紫外分光光度計(jì)在470nm波長下比色，每隔1min記錄1次吸光度，共記錄5次，然后以每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)酶活性單位(U)。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，取其平均值。酶活性=(△A470×VT)/(W×VS×0.01×t)。(2)式(2)中，△A470為470nm條件下，反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光值的變化；VT為酶液總體積(mL)；W為試驗(yàn)材料鮮質(zhì)量(g)；VS為測定時(shí)所取的酶液體積(mL)；t為反應(yīng)時(shí)間(min);酶活性

4、單位為U·min-1g-1FW酶活測定所需試劑配制方法：（1）pH7.0的磷酸緩沖液：參照植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)用書配制。（2）pH7.0的磷酸緩沖液（含1%聚乙烯吡咯烷酮和10mmol/L的抗壞血酸）：1000ml的pH7.0磷酸緩沖液中加入10g聚乙烯吡咯烷酮和1.761g抗壞血酸溶解即可。(3)0.2mol/L鄰苯二酚溶液稱取11g鄰苯二酚用500mLpH=7.0的磷酸緩沖液溶解。(4)POD反應(yīng)液0.125mL愈創(chuàng)木酚+0.255mL30%H2O2，用pH7.0磷酸緩沖液稀釋至250mL.測定酶促反應(yīng)底物含量變化2.果皮總酚含量取1g石榴果皮研磨成勻漿，加入20ml60%的乙醇

5、于50ml三角燒瓶中，超聲波60℃提取40min，后過濾至25ml容量瓶并定容（60%的乙醇）測定時(shí)取1ml0.5mol/L的福林酚試劑加入50微升提取液振蕩混勻，再加入4ml0.5mol/L的Na2CO3溶液室溫下反應(yīng)60min，后于750nm比色測定其吸光值A(chǔ)750。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。果皮總酚測定所需試劑配制方法：（1）60%的乙醇：取60ml純乙醇用蒸餾水定容至100ml即可。（2）0.5mol/L的福林酚：購買福林酚（酚測定2mol/L）用蒸餾水稀釋至0.5mol/L.(3)0.5mol/LNa2CO3：稱取53gNa2CO3加蒸餾水定容至1000ml。（4）沒

6、食子酸為標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:精密稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.010g，用蒸餾水溶解并定容至100mL，得濃度為0.1mg/mL，取此溶液5mL定容到10mL,濃度為0.05mg/mL。分別取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0mL于10mL容量瓶中，分別加入福林酚試劑1mL，混勻，在0.5～8min內(nèi)加入4mL0.5mol/L的Na2CO3溶液，充分混合后定容，室溫下放置60min，以空白試劑為對(duì)照，750nm下測定吸光值，每個(gè)樣品平行測定三次。由吸光值對(duì)濃度回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.DPPH自由基清除法測定抗氧化活性取2方法制備的酚類物質(zhì)提取液

7、2.0ml，再加入0.8mmol/LDPPH試劑2.0mL,強(qiáng)烈振蕩后靜置30min，以無水乙醇為空白，于517nm處測定反應(yīng)液的吸光度值。按下式計(jì)算DPPH清除率：DPPH清除率（%）=[1-(Ai-Aj)/Ao]×100Ai為提取液與DPPH試劑混合液的吸光值；Aj為提取液與無水乙醇混合液的吸光值；Ao為DPPH試劑與無水乙醇混合液的吸光值。試劑制備方法：0.8mmol/LDPPH：準(zhǔn)確稱取0.0315gDPPH，用無水乙醇溶解，并定量轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，搖勻