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1、中 國(guó) 生 物 工 程 雜 志第23卷第6期CHINABIOTECHNOLOGY2003年6月卡那霉素在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用及3其抗性基因的生物安全性評(píng)價(jià)33王紫萱 易自力(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 長(zhǎng)沙 410128)摘要 介紹了卡那霉素在轉(zhuǎn)基因植物篩選中的作用機(jī)理及其在植物轉(zhuǎn)化過(guò)程和轉(zhuǎn)化后代中的應(yīng)用現(xiàn)狀?？敲顾夭粌H在植物轉(zhuǎn)化過(guò)程中可起到篩選作用,而且在轉(zhuǎn)化后代中可通過(guò)其對(duì)后代進(jìn)行遺傳分析和測(cè)定種子純度,同時(shí)還可用于后代田間成株的篩選。隨著卡那霉素的廣泛使用,卡那霉素抗性基因的安全性問(wèn)題日益受到重視。概述了轉(zhuǎn)基因植物的雜草化、卡那霉素抗性基因的水平擴(kuò)散、抗
2、生素醫(yī)療安全性和食用安全性等方面的研究進(jìn)展。關(guān)鍵詞 卡那霉素 轉(zhuǎn)基因植物 生物安全性 轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因主要有兩大類,即目的影響,能正常生長(zhǎng)、發(fā)育、分化,從而把轉(zhuǎn)化體篩的基因和標(biāo)記基因。標(biāo)記基因是幫助對(duì)轉(zhuǎn)基因生選出來(lái)。物工程體進(jìn)行篩選和鑒定的一類外源基因,它包括卡那霉素能對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行篩選實(shí)質(zhì)上是通[1]選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因。在選擇壓力下,不含過(guò)卡那霉素抗性基因起作用的?？敲顾乜剐詒標(biāo)記基因及其產(chǎn)物的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞和組織死亡,而轉(zhuǎn)(Kan)基因即新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(npt2Ⅱ),亦可化細(xì)胞由于有抗性,可以繼續(xù)存活,因而有利于從稱為氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ基因
3、(aph2Ⅱ),它來(lái)自大[1,2]大量的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞和組織中選擇出轉(zhuǎn)化克隆。腸桿菌(E.coli)的aphA2基因。是目前在植物基因目前,在植物轉(zhuǎn)基因中使用的篩選劑主要有抗轉(zhuǎn)化中應(yīng)用最廣泛的選擇標(biāo)記基因。它編碼的產(chǎn)物生素類,除草劑類,氨甲喋呤,氨基酸類。在抗生素氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH(3′)Ⅱ—酶)能對(duì)氨基糖苷類中[3],主要有卡那霉素(kanamycin,Kan)、潮霉素類抗生素———卡那霉素具有抗性。此酶最早是從(hygromycin,Hyg),慶大霉素衍生物(geneticin,G418)細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn5中分離得到的,它的作用原理是:等,其中卡那霉素在植物
4、的遺傳轉(zhuǎn)化中是應(yīng)用最早npt2Ⅱ基因產(chǎn)物通過(guò)酶促磷酸化使氨基糖苷類抗生最廣泛的一種篩選劑。因此其篩選效果和抗性基素失效,從而解除毒性。因?yàn)榭敲顾啬芨蓴_一般因的生物安全性問(wèn)題受到了人們的普遍關(guān)注。植物細(xì)胞葉綠體及線粒體的蛋白質(zhì)合成,引起植物綠色器官的黃化,最終導(dǎo)致植物細(xì)胞的死亡。而轉(zhuǎn)1 卡那霉素的作用機(jī)理基因植物由于含有卡那霉素抗性(npt2Ⅱ)基因而抑制卡那霉素是目前植物基因工程中被廣泛應(yīng)用了卡那霉素的作用,所以通過(guò)卡那霉素,轉(zhuǎn)化體就很的選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記的功能是在選擇壓力下把容易從非轉(zhuǎn)化體中篩選出來(lái)。轉(zhuǎn)化體選擇出來(lái)。為達(dá)到這一目的,首先要在選擇培養(yǎng)基或選擇溶液
5、中加入篩選劑,產(chǎn)生一種選擇壓2 卡那霉素在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用力,使未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長(zhǎng);其次是選擇標(biāo)記基因2.1卡那霉素在植物轉(zhuǎn)化過(guò)程中的篩選作用的產(chǎn)物對(duì)篩選劑產(chǎn)生抗性使轉(zhuǎn)化細(xì)胞不受篩選劑在植物的遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中,由于轉(zhuǎn)化體很少,所以必須進(jìn)行篩選,卡那霉素作為一種篩選劑常常收稿日期:2002212226 修回日期:2003203210加入選擇培養(yǎng)基中對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行篩選。但卡那霉3863基金項(xiàng)目資助(101201201201)素毒性不能太高,因?yàn)楫?dāng)卡那霉素對(duì)未轉(zhuǎn)化細(xì)胞有33通訊作者,電子信箱:yzlzj@public.cs.hn.gov強(qiáng)毒害時(shí),細(xì)胞將快速死亡,死亡或?qū)⒁?/p>
6、死亡的細(xì)?1995-2004TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.,Ltd.Allrightsreserved.10中 國(guó) 生 物 工 程 雜 志第23卷胞對(duì)鄰近的細(xì)胞將產(chǎn)生抑制作用,不利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞現(xiàn)象,可以分析外源基因的遺傳特點(diǎn)。林良斌[3][11]生長(zhǎng)。因?yàn)椴煌参锏牟煌庵搀w對(duì)卡那霉素等將轉(zhuǎn)基因代(T0代)抗性種子在含卡那霉素的的敏感性不一樣,所以篩選濃度也不一樣,因此在培養(yǎng)基中萌發(fā),后代(T1代)植株有性狀分離現(xiàn)象,轉(zhuǎn)化之前,應(yīng)對(duì)卡那霉素設(shè)置一系列的濃度梯度,卡那霉素抗性株與敏感株的分離比約為3∶1,由此找出植物對(duì)卡那霉素的敏感性濃度
7、,以便在這個(gè)適說(shuō)明外源基因是以單拷貝、雜合地整合到轉(zhuǎn)基因植[12]當(dāng)?shù)臈l件下,非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)能有效地抑制,緩株的基因組中。相似地,商鴻生等將轉(zhuǎn)基因線慢死亡。一般說(shuō)來(lái),單子葉植物對(duì)卡那霉素的敏感辣椒的T2代純合系自交,得到T22T4代種子,同時(shí)程度較雙子葉弱,因此在篩選過(guò)程中,單子葉植物將T2代植株與轉(zhuǎn)化株雜交得F1、F2代種子,將這的篩選濃度要較雙子葉高。比如說(shuō)水稻,在遺傳轉(zhuǎn)些種子在含卡那霉素300mgPL的培養(yǎng)基上萌發(fā),結(jié)化過(guò)程中卡那霉素對(duì)水稻愈傷組織的篩選濃度達(dá)果表明,抗卡那霉素標(biāo)記基因在自交和雜交各代都到了500mgPL,由于卡那霉素毒性太高會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)能穩(wěn)
8、定地高效表
