利用抑制消減雜交分離受褐飛虱取食下調(diào)的水稻基因

《利用抑制消減雜交分離受褐飛虱取食下調(diào)的水稻基因》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。

1、3期袁紅雨等:利用抑制消減雜交分離受褐飛虱取食下調(diào)的水稻基因305利用抑制消減雜交分離受褐飛虱取食下調(diào)的水稻基因*袁紅雨祝莉莉唐　明何光存(武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，植物發(fā)育生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430072)摘要：為了分離受褐飛虱取食抑制的水稻基因，采用下部莖干變黑，整株死亡。盡管褐飛虱對(duì)水稻的抑制消減雜交的方法，以正常生長(zhǎng)的水稻幼苗為目標(biāo)危害是多方面的，但褐飛虱連續(xù)取食，導(dǎo)致水稻群體，以褐飛虱脅迫32h的水稻幼苗作為對(duì)照群體，構(gòu)植株養(yǎng)分虧缺是造成植株死亡的主要原因，所以建了含200個(gè)重組質(zhì)粒的SSHcDNA文庫(kù)

2、。隨機(jī)挑選水稻對(duì)褐飛虱的反應(yīng)整合了植株對(duì)養(yǎng)分虧缺的反50個(gè)重組質(zhì)粒進(jìn)行反向Northern差異篩選后，再經(jīng)Northern雜交驗(yàn)證，得到2個(gè)受褐飛虱取食抑制的基應(yīng)，而以往在研究植物對(duì)昆蟲的防御反應(yīng)時(shí)缺乏因：一個(gè)是Lhca，編碼水稻光系統(tǒng)I天線蛋白；另一個(gè)對(duì)養(yǎng)分虧缺方面的考慮。基因(BpHd002)與肌苷-5’-單磷酸脫氫酶基因有同源　　被昆蟲取食后，植物體內(nèi)的代謝活動(dòng)發(fā)生顯性。以BpHd002為探針篩選水稻幼苗cDNA文庫(kù)分離著的變化，比如光合速率下降，植物體把氮源和碳出該基因的全長(zhǎng)cDNA(BpHd002A)。其長(zhǎng)

3、度為1285源從生長(zhǎng)代謝調(diào)配給防衛(wèi)反應(yīng)(Watanabe和bp，含有一由519bp組成的完整的閱讀框，編碼的蛋Kitagawa2000)。分離和鑒定受褐飛虱取食調(diào)節(jié)的白質(zhì)具有兩個(gè)CBS結(jié)構(gòu)域。基因有助于理解植物防衛(wèi)反應(yīng)的機(jī)制。關(guān)鍵詞：抑制消減雜交；褐飛虱；水稻；肌苷-5’-單磷酸脫氫酶；BpHd002A1材料與方法中圖分類號(hào)：Q741.1　材料　　分子生物學(xué)的理論和技術(shù)不斷發(fā)展和完善，　　在直徑為10cm的塑料杯內(nèi)均勻播種20粒水使人們能夠從分子水平上研究植物與昆蟲的相互作稻(OryzasativaL.)明恢63的種

4、子。當(dāng)水稻幼苗長(zhǎng)用機(jī)制。植物體對(duì)昆蟲取食所做出的反應(yīng)十分復(fù)到兩葉一心時(shí)，每一幼苗上接10頭左右2～3齡雜,昆蟲取食不可避免地對(duì)植物體產(chǎn)生機(jī)械傷害，褐飛虱若蟲，并把杯子及幼苗用通風(fēng)良好的網(wǎng)罩傷害反應(yīng)在植物體抵御昆蟲取食的反應(yīng)中處于中心罩上。接蟲后，每隔一定時(shí)間剪取水稻幼苗，并地位(Kessler和Baldwin2002)。昆蟲取食時(shí)產(chǎn)生立即浸泡在液氮中，用于RNA的提取。的專一性引發(fā)子(elicitor)會(huì)改變植物體的傷害反應(yīng),1.2總RNA及mRNA的提取使之能更有效地抵御昆蟲的取食(Reymond等　　總RNA及m

5、RNA的分離提取按照TRIzolRNA2000)。另外，昆蟲取食時(shí)在植物體上產(chǎn)生的傷提取試劑(GibcoBRL)及MESSAGEMAKER口會(huì)成為微生物侵染的部位，而且某些植食性昆ReagentAssembly試劑盒(GibcoBRL)說(shuō)明書進(jìn)行。蟲又?jǐn)y帶病原菌，這也是植物體內(nèi)參與調(diào)節(jié)植物1.3SSH實(shí)驗(yàn)體與病原菌以及植物體與昆蟲相互作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)SSH實(shí)驗(yàn)采用ClotechPCRcDNAsubtraction途徑相互重疊的原因(Moran和Thompson2001)。kit。基本步驟如下：①分別提取對(duì)照群體＋煙草被

6、煙草天蛾取食時(shí)發(fā)生顯著變化的5個(gè)基因，(driver)和目標(biāo)群體(tester)兩種幼苗的poly(A)在擬南芥中卻不受菜粉蝶取食的影響(HermsmeierRNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；②用RsaI把兩種等2001)。這種植物體與昆蟲的相互作用在物種間cDNA平均切成<500bp的片斷；③把目標(biāo)群體的差別又進(jìn)一步增加了問(wèn)題的復(fù)雜性。cDNA均分成2份，分別連上不同的接頭，然后　　褐飛虱(brownplanthopper，BPH)是水稻的重再分別與變性過(guò)量的對(duì)照群體cDNA雜交；④雜要害蟲，食性單一，只能在水稻和普通野

7、生稻上取食和繁殖后代。以成蟲、若蟲群集方式在稻叢2003-09-26收到，2004-02-16接受。國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30170085)資助?；课持?，被害部位呈長(zhǎng)形棕色斑，嚴(yán)重時(shí)*通訊作者(E-mail:gche@whu.edu.cn;Tel:027-87682384)。306植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)30卷交后，將兩份樣本混合，再繼續(xù)與變性的對(duì)照planthopperdepressed)，它們代表著受褐飛虱取食群體cDNA雜交；⑤經(jīng)抑制PCR和巢式PCR擴(kuò)抑制的基因。還有一個(gè)克隆對(duì)兩種材料的雜交信增，

8、再將擴(kuò)增產(chǎn)物插入pT-Adv載體，轉(zhuǎn)化大腸號(hào)相近(圖略)。其余3個(gè)克隆與兩種材料雜交均無(wú)桿菌TOP10F’獲得SSHcDNA文庫(kù)；⑥通過(guò)陽(yáng)性信號(hào)(圖略)。藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)從SSHcDNA文庫(kù)中篩選出含有插入片斷的克隆。1.4　差示篩選SSHcDNA文庫(kù)　　從SSHcDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取50個(gè)重組子，分別編號(hào)，抽提質(zhì)粒，點(diǎn)印于尼龍膜上，制備2套重復(fù)拷貝