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1、中國(guó)果樹ChinaFruits1998(2):47—491998年5月*活體梨葉片透明方法實(shí)驗(yàn)技術(shù)與李保華趙美琦孫月海方法(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系,北京100094)活體葉片透明技術(shù)是研究病原菌侵染、擴(kuò)展、發(fā)清后,按乳酚油200mL無(wú)水乙醇132mL三氯甲烷病過(guò)程及寄主組織病變的重要方法。流行病害的定66mL的比例配成乳酚油透明液〔1〕。量研究,尤其對(duì)于果樹葉部流行病害的定量研究,若透明將新鮮葉片直接浸入乳酚油透明液中,以葉片為試材,經(jīng)透明處理后,不僅可檢測(cè)病原菌孢室溫下處理48小時(shí)。透明葉片量不能超過(guò)透明液量子侵入率、菌絲擴(kuò)展長(zhǎng)度,達(dá)到定量研究的目的,
2、而的1/2。且克服了以苗木為試材的諸多弊端。以病原菌侵染、擴(kuò)展為觀察目的的梨樹活體葉片透明和染色方法,1.2染色與脫色以往未見報(bào)道。我們?cè)诶婧谛遣〉那秩?、發(fā)病研究染色液的配制稱取溴酚藍(lán)1g,溶入100mL水中,將用于小麥條銹病組織學(xué)觀察的水合三氯乙醛合三氯乙醛溶液中,配成1%溴酚藍(lán)染色液。溴酚藍(lán)煮沸透明〔2〕和乳酚油透明液透明技術(shù)〔1〕〔3〕引入到梨染色液可將梨黑星病菌的菌絲細(xì)胞壁染成藍(lán)色,而黑星病的流行學(xué)定量研究中,并對(duì)這種透明方法的葉組織細(xì)胞不被染色。脫色液為飽和水合三氯乙醛。透明機(jī)理和各自應(yīng)用范圍作了進(jìn)一步的研究。在組染色和脫色經(jīng)上述兩種方法透明的葉片
3、,浸織透明的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討了表皮剝離方法,以獲入染色液中染色48小時(shí)。染色完畢,取出染色葉片,得對(duì)表皮表面結(jié)構(gòu)和孢子侵染位點(diǎn)的清晰觀察結(jié)用自來(lái)水漂去葉片表面的染色液,轉(zhuǎn)入飽和水合三果。氯乙醛溶液中脫色24小時(shí)。脫色后的葉片以甘油作1材料和方法浮載劑制成半永久玻片;脫色后的葉組織也可在飽和水合三氯乙醛溶液中保存。材料為鴨梨不同葉齡(10—180日齡)完整葉片和葉片的活體徒手切片,厚度為20—100m。1.3表皮剝離表皮剝離液的配制將草酸和草酸銨分別配成1.1透明方法0.8%和3.2%的水溶液,使用時(shí)再按11的比例混合1.1.1飽和水合三氯乙醛溶液煮沸透
4、明法即成〔4〕。透明液配制將水合三氯乙醛〔CCl3CH(OH)2〕表皮剝離方法將透明或染色脫色的葉片直接和蒸餾水按52(W/V)的比例混合,待水合三氯乙醛浸入表皮剝離液中處理24小時(shí)。處理完畢,取出葉片完全溶解后,即配成飽和水合三氯乙醛透明液〔2〕。并用清水沖掉表皮剝離液,用攝子撕取表皮,用毛筆刷去附著的葉肉細(xì)胞,即可以甘油作浮載劑制片觀透明將飽和水合三氯乙醛加熱至沸騰,立即察。放入待透明材料,煮沸1—5分鐘。1.1.2乳酚油透明液透明法2結(jié)果透明液配制該透明液配制分兩步,首先按苯酚20g甘油40mL乳酸20mL蒸餾水20mL的比本文于1998-01
5、-18收到。*本研究為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目,資助號(hào):例,將其配成乳酚油,待苯酚完全溶解,溶液混勻澄39470475。本文承蒙曾士邁先生審閱,特致謝忱。4724小時(shí)的顯微照片,照片中梨黑星病菌分生孢子接2.1飽和水合三氯乙醛溶液煮沸透明法種4天后在角質(zhì)層下形成的菌絲(10×40倍)清晰可經(jīng)飽和水合三氯乙醛透明的葉片,縱切片在顯見。微鏡下觀察,僅能檢查到葉組織細(xì)胞壁、細(xì)胞核和維2.2乳酚油透明液透明法管束的纖維素類物質(zhì),細(xì)胞膜和葉綠體、線粒體等細(xì)胞器均受到破壞,細(xì)胞內(nèi)容物消失,這說(shuō)明水合三氯經(jīng)乳酚油透明液透明的葉片,其縱切片在顯微乙醛主要通過(guò)破壞細(xì)胞膜、消解
6、細(xì)胞質(zhì),來(lái)達(dá)到透明鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,與透明前相比,細(xì)胞質(zhì)稠效果。如果煮沸時(shí)間過(guò)長(zhǎng),細(xì)胞壁也將被逐漸消解。密,細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞壁略有分離,葉綠體消解為多個(gè)微圖A為飽和水合三氯乙醛溶液煮沸透明后鴨梨葉片小的棕色顆粒,葉綠素消失。由此說(shuō)明,該透明液主縱切片(10×4倍),圖B為飽和水合三氯乙醛溶液煮要通過(guò)分解葉綠素,破壞葉綠體達(dá)到透明的效果,對(duì)沸透明后的葉肉細(xì)胞(10×40倍)。飽和水合三氯乙細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)損傷不大。圖C為該透明液透明的醛溶液煮沸透明對(duì)梨各齡期葉片都能獲得較好的透鴨梨葉片縱切片(10×40倍),圖D為葉肉細(xì)胞(10×明效果,不同齡期葉片透明需要煮沸
7、的時(shí)間有所差40倍)。乳酚油透明液透明鴨梨30日齡以內(nèi)的幼葉和異,幼嫩葉片煮沸時(shí)間短,一般不超過(guò)3分鐘;葉齡30葉綠素已開始分解的衰老葉片(10月中旬以后),均日以上的葉片,煮沸時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng),透明過(guò)程中可能獲得較好的透明效果。透明后的葉片呈淡黃色、透隨時(shí)檢查透明效果,以葉片剛好完全透明為止。圖F亮。圖G是鴨梨25日齡葉片經(jīng)乳酚油透明液透明48為鴨梨35日齡葉片經(jīng)飽和水合三氯乙醛溶液煮沸透小時(shí)、溴酚藍(lán)染色48小時(shí)、飽和水合三氯乙醛脫色24明3分鐘、溴酚藍(lán)染色48小時(shí)和飽和水三氯乙醛脫色小時(shí)后的顯微照片,從該照片可清楚看到葉片正面圖活體梨葉片兩種透明方法的透明
8、機(jī)制及效果比較注:Co、Mc和St分別為梨黑星病菌的
