熱鹽水致大鼠萎縮性胃炎胃粘膜組織細(xì)胞凋亡

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1、210陜西醫(yī)學(xué)雜志2003年3月第32卷第3期熱鹽水致大鼠萎縮性胃炎胃粘膜組織細(xì)胞凋亡及其調(diào)控基因蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究西安市中心醫(yī)院消化科(西安710003)張玲霞　張　瀝　徐俊榮　賈長(zhǎng)河　張寧霞　曹廣周　　摘　要　目的:研究熱鹽水灌胃導(dǎo)致的大鼠萎縮性胃炎胃粘膜組織中的凋亡細(xì)胞及其調(diào)控基因Bcl22、Fas表達(dá)狀態(tài),以探討長(zhǎng)期熱咸飲食與慢性萎縮性胃炎發(fā)生的關(guān)系。方法:采用脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)等缺口末端標(biāo)記(TUNEL)技術(shù)及免疫組織化學(xué)染色技術(shù)。細(xì)胞凋亡時(shí)DNA含量分析采用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)。結(jié)果:TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡顯示,在熱鹽水所致的大鼠萎縮性胃炎中凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多,

2、在粘膜全層均可見(jiàn)到,呈彌漫性分布。萎縮性胃炎中凋亡細(xì)胞指數(shù)顯著高于正常大鼠胃粘膜;免疫組化法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因顯示,Bcl22、Fas在熱鹽水灌胃所致的萎縮性胃炎中的表達(dá)率顯著高于正常胃粘膜;熱鹽水灌胃不同時(shí)間大鼠胃粘膜中Bcl22、Fas蛋白表達(dá)率隨灌胃時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加,在4周、8周、12周時(shí)Bcl22蛋白表達(dá)率分別為12.5%、16.7%、76.5%,Fas蛋白表達(dá)率分別為18.75%、22.2%、64.7%;流式細(xì)胞檢測(cè)顯示,在萎縮性胃炎時(shí),在G0?G1峰前可見(jiàn)一個(gè)亞G0?G1峰,也即凋亡細(xì)胞峰出現(xiàn),而在正常胃粘膜時(shí)未顯示亞G0?G1峰。結(jié)論:熱鹽水灌胃可導(dǎo)致大鼠胃粘膜組

3、織細(xì)胞凋亡異常,其調(diào)控基因(Bcl22、Fas)在熱鹽水所致的大鼠萎縮性胃炎發(fā)生中起重要作用?！　≈黝}詞　胃炎,萎縮性?病理學(xué)　氯化鈉類?副作用　@細(xì)胞凋亡　基因,調(diào)節(jié)　大鼠　　本研究采用脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)等缺口2.1　大鼠萎縮性胃炎模型的制作:采用末端標(biāo)記(TUNEL)技術(shù)、流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)及55℃、15%的鹽水連續(xù)灌胃12周,制成大鼠萎縮免疫組織化學(xué)染色技術(shù)對(duì)熱鹽水灌胃導(dǎo)致的大鼠性胃炎模型,在灌胃期間每隔4周處死一批大鼠。萎縮性胃炎胃粘膜上皮組織中的凋亡細(xì)胞及其調(diào)對(duì)照組采用等量的蒸餾水灌胃12周。具體造模方[1]控基因(Bcl22、Fas)表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行觀察,以探討它法見(jiàn)

4、參考文獻(xiàn)。收集制模階段的大鼠胃粘膜石們?cè)跓猁}水灌胃導(dǎo)致的大鼠萎縮性胃炎發(fā)生中所蠟包埋標(biāo)本68例(其中萎縮性胃炎標(biāo)本34例)及起的作用,探討食物的溫度及咸度造成胃粘膜萎對(duì)照組大鼠胃粘膜石蠟包埋標(biāo)本32例進(jìn)行檢測(cè)?？s的原因,為預(yù)防胃癌前病變和胃癌的發(fā)生提供2.2　細(xì)胞凋亡的檢測(cè):采用末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。的dUTP切口末端標(biāo)記法(TUNEL)。染色步驟:材料與方法①4Lm石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化;1　材　料　100只7周齡健康、性成熟的雄②新鮮配制3%H2O2及90%甲醇混合液封閉,室性SD大鼠,體重200～250g,由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)溫處理10min阻斷內(nèi)源酶;③加TB

5、S1:100稀釋物實(shí)驗(yàn)中心提供;細(xì)胞凋亡試劑盒(InSituCellProteinaseK37℃消化15min;④加標(biāo)記緩沖液ApoptosisDetctionKitI,POD),SABC、即用型(LabelingBuffer)20Ll?片,以保持切片濕潤(rùn),4℃試劑盒、Bcl22、Fas一抗、生物素化的二抗均購(gòu)自過(guò)夜20h,取出再置37℃標(biāo)記2h;⑤加封閉液武漢博士德生物技術(shù)公司;流式細(xì)胞檢測(cè)采用50Ll?片,室溫30min;⑥用封閉液1∶100稀釋生USA2Coulter公司流式細(xì)胞儀(ELITE型)。物素化抗地高辛抗體,50Ll?片,37℃反應(yīng)30min;2　方　法⑦用TA

6、B1∶100稀釋SABC,混勻后加至切片,陜西醫(yī)學(xué)雜志2003年3月第32卷第3期21137℃反應(yīng)30min;2～3步后蒸餾水洗滌3次,每次表1　大鼠正常胃粘膜、萎縮性胃炎中2min;6～7步后TBS洗滌3次,每次2min;⑧Bcl22、Fas蛋白表達(dá)率DAB2H2O2顯色10min,蘇木素輕度復(fù)染,脫水透Bcl22蛋白表達(dá)Fas蛋白表達(dá)率明,封片。病理檢查n陽(yáng)性例數(shù)%陽(yáng)性例數(shù)%2.3　免疫組織化學(xué)染色:采用SABC即用正常胃粘膜32412.5618.7型試劑盒,切片常規(guī)脫蠟水化,經(jīng)3%過(guò)氧化氫23萎縮性胃炎342676.52264.790%甲醇封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶20min,

7、微波修復(fù)抗原10min,山羊血清孵育25min后加一抗　　注:3與正常胃粘膜比較,P<0.01(P53、ras),4℃冰箱過(guò)夜,次日加對(duì)應(yīng)的生物素化2　免疫組化法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因　Bcl22、二抗,37℃,30min;ABC復(fù)合物,37℃,30min。之Fas陽(yáng)性反應(yīng)物呈棕黃色,主要位于胞漿中,個(gè)別后用DAB顯色。以上各步驟除血清孵育后甩干病例在胞核中也有表達(dá),見(jiàn)圖2、3。Bcl22、Fas在血清直接加一抗外,均間以PBS洗滌3次,每次3熱鹽水致大鼠萎縮性胃炎中的表達(dá)率顯著高于正～5min。