Salusin—a基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)

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1、砸循環(huán)學(xué)雜志，2010，20(1)：25～28⑥2010CHINESEJOURNALOFMICROCIRCULAT1ONSalusin—a基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)游莎曾和松[中圖分類號(hào)]R541．4Q344．13[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1005—1740(2010)01—0025—04有限公司提供。脂質(zhì)體(Lipofect2000)轉(zhuǎn)染試劑為國(guó)一美國(guó)Invitrogen產(chǎn)品。1．2方法1．2．1THP一1細(xì)胞培養(yǎng)及RNA提?。篢HP一1細(xì)胞用1640培養(yǎng)基加10％胎牛血清，于37℃

2、、5CO。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液、傳代，用Trizol提取總RNA。1．2．2THP一1細(xì)胞Salusin—a基因的擴(kuò)增：提取THP一1細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄，用RTPCR試劑盒合成Perprosalusin第一鏈cDNA。以Salusin—acD—NA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Salusin～a上游引物序列：5一TGCTCGAGGGTGCCCTTCCTC一3；下游引物序歹U：5一TAGGATCCCGTCCCTTGGCTCCA一3，引物由上海生工合成。反應(yīng)體系為50／,l，cDNA模板2pl，上下游引物各lul，2

3、．5mmol／LdNTP1／A，10×TaqDNA聚合酶緩沖液5,1，MgCL。4td，pfuDNA聚合酶1／A，ddH：O35l。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性2．5min，94。C1min，60。C1min，72℃2min，35個(gè)循環(huán)，72。C10min，獲得Satusin—a目的1材料與方法片段，用1．5瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大量擴(kuò)增并回1．1材料收PCR產(chǎn)物。人單核細(xì)胞系THP一】細(xì)胞、HEK293細(xì)胞購(gòu)自1．2．3重組pEGFP—N3一Salusin—a質(zhì)粒的構(gòu)建：回武漢細(xì)胞典藏中心。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白真核表達(dá)

4、收純化Salusin—a片段和pEGFP—N3，同時(shí)用XhoI載體一N3(pEGFP—N3)和大腸桿菌DH5a感受肽細(xì)和BamH1雙酶切(37

5、C，12h)，回收Salusin-a片段胞由本科實(shí)驗(yàn)室提供。1640及DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于和線性pEGFP-N3。用T4DNA連接酶連接Salusin-a美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清為杭州四季青有限公片段和線性pEGFPN3。連接體系和條件：線性司產(chǎn)品。Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶AMV合酶、PCR試pEGFPN32tLl，Salusin—a10“l(fā)，Buffer2．5

6、Ⅱl，T4DNA劑盒、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、凝膠回收試連接酶1>1，ddH2O9．5l，16℃，連接過(guò)夜。將重組劑盒及質(zhì)粒小量抽提試劑盒由天根生化科技(北京)pEGFP-N3一Salusin-a轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素篩選平板培養(yǎng)過(guò)夜，挑取細(xì)菌克隆，小提質(zhì)粒雙酶[作者單位]華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心內(nèi)科，郵政切、菌落PCR和測(cè)序鑒定，以確認(rèn)pEGFP—N3一Sa—編碼武漢430030；通訊作者：曾和松，Email：zenghesong@163．cornlusin-a質(zhì)粒構(gòu)建成功。大量

7、擴(kuò)增該質(zhì)粒備用。本文2009—09—30收到，2009—1026修回，20091202接受1．2．4pEGFP—N3一Salusin—a質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293：壤餌師學(xué)雜志基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)20】o年第20卷第1期26游莎．曾和松將HEK293細(xì)胞于10胎牛血清DMEM培養(yǎng)基計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示，多組間中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。轉(zhuǎn)染前24h，用0．25胰酶消化，比較采用One—WayANOVA單因素方差分析，兩按5×10jcells／well接種于6孔板中至培養(yǎng)細(xì)胞約組間比較采用t檢驗(yàn)，利用SPSS10．0軟件進(jìn)行統(tǒng)

8、65；轉(zhuǎn)染前用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞4h，將1．計(jì)學(xué)分析，P

9、粒對(duì)照組、轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，用熒光顯微鏡觀察其綠色熒光蛋白表達(dá)。采用流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))獲取轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)。470bp1．2．6轉(zhuǎn)染細(xì)胞Salusin—amRNA表達(dá)：收集以上HEK293細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后，加入Trizol裂解液，600bp按說(shuō)明書(shū)提取總RNA，采用RT—PCR檢測(cè)Salusin—500bp400bpamRNA的表達(dá)。PCR反應(yīng)體系5Ol，反應(yīng)條件：