AKTIP基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在GES-1細(xì)胞中的表達(dá)

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1、第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)(JFourthMilMedUniv)2008，29(23)http：／／journa1．fmmu．edu．ca2127·研究原著·文章編號：1000-2790(2008)23-2127-04AKTIP基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在GES．1細(xì)胞中的表達(dá)利榮喬，黃俏佳(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)研究中心，福建福州350025)Constructionofeukaryoticexpression達(dá)載體，并成功地在GES．1細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)，為進(jìn)一步研究AKTIP的功能和結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)．vectorofAKTIPgeneandits

2、expres-【關(guān)鍵詞】蛋白激酶B相互作用蛋白；逆轉(zhuǎn)錄一PCR；基因克sioninGES．1cells隆；基因轉(zhuǎn)染；蛋白質(zhì)印跡技術(shù)L／Rong—Qiao，HUANGQiao—Jia【中圖號】Q556【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】ACenterforMolecularMedicine，F(xiàn)uzhouGeneralHospital，NanjingMilitaryAreaCommand，F(xiàn)uzhou350025，China0引言蛋白激酶B相互作用蛋白(AKTinteractingpro—【Abstract】AIM：Toconstructeukaryoticexpre

3、ssionvectorofthetein，AKTIP)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞膜蛋白質(zhì)?．geneofAKTinteractingprotein(AKTIP)andtodetectitsexpres—AKTIP可直接或問接作用于蛋白激酶B(proteinki．sioninGES一1cells．METH0DS：TotalRNAwasextractedfromnaseB，PKB或Akt)，通過增強(qiáng)Akt的磷酸化調(diào)節(jié)Akthumanperipheralblood．ThefulllengthcDNAofAKTIPgene的活性，從而參與磷脂酰肌醇-3激

4、酶(PI3K)／Akt信wasamplifiedbyRT—PCR，andthenclonedintopcDNA3．1／號通路的調(diào)控J．到目前為止，有關(guān)AKTIP的研究myc—His(一)AvectorbynIandNheIrestrictiveenzymesites．Thegenewasidentifiedandcomfirmedbysequencing，andwas文獻(xiàn)報(bào)道很少，其確切的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能尚未完全thentransfectedintoGES一1cells，andtheexpressedAKTIPpro—清楚．我們利用基因克隆技

5、術(shù)構(gòu)建AKTIP基因的真teinwasdetectedbyWesternblotanalysis．RESULTS：These—核表達(dá)載體并進(jìn)行AKTIP蛋白的體外表達(dá)，為進(jìn)一qencingresultconfirmedtheeukaryoticexpressionvectorof步研究其結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)．AKTIPwascorrectlyconstructed，andtheresultofWesternblotshowedithadagoodexpressioninGES一1cells．CONCLUSION：1材料和方法pcDNA3．1／m

6、yc—His(一)A—AKTIPhasbeensuccessfully1．1材料PCR引物由上海超世生物科技有限公constructed，whichcanhaveagoodexpressioninGES一1cells．司合成；DH5(x菌種為本實(shí)驗(yàn)室保存；pcDNA3．1／Thisstudywillprovideafoundationforfurtherinvestigationonthemyc—His(一)A空質(zhì)粒、DMEM培養(yǎng)基、胰酶及真核細(xì)functionandmolecularconstitutionofAKTIP．胞轉(zhuǎn)染試劑Lipo

7、fectamineⅢ2000為Invitrogen公司產(chǎn)【Keywords】AKTIP；RT—PCR；genecloning；genetransfection；WesterRblot品；全血RNA提取試劑盒、質(zhì)粒DNA小抽和大抽提試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒為TIANGEN公司產(chǎn)【摘要】目的：構(gòu)建人蛋白激酶B相互作用蛋白(AKTIP)基品；AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、nI，NheI限制性內(nèi)切酶和T4．因編碼區(qū)序列(cDNA)的真核表達(dá)載體，觀察其在GES一1細(xì)胞DNA連接酶、GES一1細(xì)胞株(永生化的正常胃黏膜細(xì)中的表達(dá)．方法：從健康人外周血中提取總RN

8、A，應(yīng)用RT—胞)，RIPAI細(xì)胞強(qiáng)裂解液、胎牛血清、PVDF膜和PCR方法擴(kuò)增AKTIPcDNA的全長序列后克隆入pcDNA3．1／ECL化學(xué)發(fā)光底物、脫脂奶粉及