人snca基因真核表達載體的構建及其在pc12細胞中的表達

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1、人SNCA基因真核表達載體的構建及其在PC12細胞中的表達：錢進軍,程言博,劉春風,楊亞萍,劉康永【摘要】　　目的:構建含人野生型及致病突變A30P、A53TSNCA基因的重組真核表達載體pEGFPC3SNCA,并通過穩(wěn)定轉染獲得過表達人野生型及致病突變A30P、A53Tαsynuclein(SNCA)的單克隆PC12細胞株。方法:通過RTPCR方法擴增SNCA基因,TA克隆后測序。在此基礎上利用單核苷酸差異引物定點誘變法相繼構建含SNCA基因編碼區(qū)EcoRI、BamHI兩酶切位點的同義突變及其致病突變G88C（Ala30Pro）、G209A（A

2、la53Thr）的重組真核表達載體pEGFPC3SNCA,并以PCR、雙酶切、測序鑒定。以重組質粒pEGFPC3SNCA通過脂質體轉染方法轉染PC12細胞;以G418進行篩選;以有限稀釋法進行亞克隆獲得穩(wěn)定過表達人野生型及致病突變A30P、A53Tαsynuclein的單克隆PC12細胞株,并以穩(wěn)定轉染pEGFPC3的PC12細胞作為對照組細胞,通過RTPCR、:ToconstructrebinanteukaryoticexpressionvectorspEGFPC3SNCAcontaininghumanutationsA30P,A53T

3、αsynuclein(SNCA),andtoobtainmonoclonalPC12celllinesoverexpressinghumanutationsA30P,A53Tαsynucleinbystabletransfection.METHODS:HumanousmutationoritsG88C(Ala30Pro)andG209A(Ala53Thr)pathogenicmutationutagensisusingprimervarianceinmononucleotide.AnddifferentrebinantplasmidspEGFPC3

4、SNCAedigestionandDNAsequencing.PC12cellsidspEGFPC3SNCAbyliposometransfectionmethod,screenediteddilutionmethodtoobtaindifferentmonoclonalPC12celllinesstablyoverexpressinghumanonoclonalPC12celllinesicroscopy.RESULTS:AccordingtoresultofPCR,thedoubledigestionandgenesequencing,itedt

5、hatrebinanteukaryoticexpressionvectorscontainingousmutationoritsAla30ProandAla53Thrpathogenicmutationhadbeenconstructedsuccessfully.BymeansofRTPCR,I1640購自Invitrogen公司;PC12細胞株購自中國科學院上海細胞所;小牛血清購自杭州四季青公司;Taq酶購自TaKaRa公司;總RNA提取試劑為Gibco的TRIzol試劑;反轉錄PCR試劑盒購自Fermanas公司;Lipofectamine2000轉

6、染試劑盒購自GbicoBRL公司;G418購自Mediatech公司;胰蛋白酶、兔抗人αsynucleinmAb購自Sigma公司;HRP標記的羊抗兔IgG的二抗購自DAKO公司;ECL顯色劑購自Amersham公司。　　1.2方法　　1.2.1PCR引物的合成根據GenBank中相應cDNA基因序列,自行設計引物,委托上海英駿生物有限公司合成,引物序列:P1:5′GTGTGGTGTAAAGGAATTCATT3′;P2:5′CGCGGATCCAGAAACTGGGAGCAAAGATA3′。　　1.2.2總RNA的提取及RTPCR擴增在50μL反應

7、體系中加入10×buffer5μL,10mmol/L,dNTP1μL,引物1、2各1μL,5U/μLTaq酶0.5μL,模板cDNA2μL,ddH2O40μL,計反應體系50μL。PCR反應條件為94℃5min,94℃30s,55℃30s,72℃45s,后3步反復進行30個循環(huán)。擴增產物用Uuiq10柱式DNA膠回收試劑盒提純?！　?.2.3野生型SNCA基因的TA克隆取膠回收產物7.5μL加入1μLTvector、1μL10×ligationbuffer、0.5μLT4DNAligase,混合為10μL連接反應體系于4℃過夜。將10μL連接液與200

8、μL感受態(tài)細菌混勻,冰浴30min后于42℃水浴90s,置冰浴2m