人snca基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在pc12細(xì)胞中的表達(dá)

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1、人SNCA基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在PC12細(xì)胞中的表達(dá)：錢進(jìn)軍,程言博,劉春風(fēng),楊亞萍,劉康永【摘要】　　目的:構(gòu)建含人野生型及致病突變A30P、A53TSNCA基因的重組真核表達(dá)載體pEGFPC3SNCA,并通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染獲得過(guò)表達(dá)人野生型及致病突變A30P、A53Tαsynuclein(SNCA)的單克隆PC12細(xì)胞株。方法:通過(guò)RTPCR方法擴(kuò)增SNCA基因,TA克隆后測(cè)序。在此基礎(chǔ)上利用單核苷酸差異引物定點(diǎn)誘變法相繼構(gòu)建含SNCA基因編碼區(qū)EcoRI、BamHI兩酶切位點(diǎn)的同義突變及其致病突變G88C（Ala30Pro）、G209A（A

2、la53Thr）的重組真核表達(dá)載體pEGFPC3SNCA,并以PCR、雙酶切、測(cè)序鑒定。以重組質(zhì)粒pEGFPC3SNCA通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞;以G418進(jìn)行篩選;以有限稀釋法進(jìn)行亞克隆獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)人野生型及致病突變A30P、A53Tαsynuclein的單克隆PC12細(xì)胞株,并以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFPC3的PC12細(xì)胞作為對(duì)照組細(xì)胞,通過(guò)RTPCR、:ToconstructrebinanteukaryoticexpressionvectorspEGFPC3SNCAcontaininghumanutationsA30P,A53T

3、αsynuclein(SNCA),andtoobtainmonoclonalPC12celllinesoverexpressinghumanutationsA30P,A53Tαsynucleinbystabletransfection.METHODS:HumanousmutationoritsG88C(Ala30Pro)andG209A(Ala53Thr)pathogenicmutationutagensisusingprimervarianceinmononucleotide.AnddifferentrebinantplasmidspEGFPC3

4、SNCAedigestionandDNAsequencing.PC12cellsidspEGFPC3SNCAbyliposometransfectionmethod,screenediteddilutionmethodtoobtaindifferentmonoclonalPC12celllinesstablyoverexpressinghumanonoclonalPC12celllinesicroscopy.RESULTS:AccordingtoresultofPCR,thedoubledigestionandgenesequencing,itedt

5、hatrebinanteukaryoticexpressionvectorscontainingousmutationoritsAla30ProandAla53Thrpathogenicmutationhadbeenconstructedsuccessfully.BymeansofRTPCR,I1640購(gòu)自Invitrogen公司;PC12細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所;小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司;Taq酶購(gòu)自TaKaRa公司;總RNA提取試劑為Gibco的TRIzol試劑;反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購(gòu)自Fermanas公司;Lipofectamine2000轉(zhuǎn)

6、染試劑盒購(gòu)自GbicoBRL公司;G418購(gòu)自Mediatech公司;胰蛋白酶、兔抗人αsynucleinmAb購(gòu)自Sigma公司;HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG的二抗購(gòu)自DAKO公司;ECL顯色劑購(gòu)自Amersham公司。　　1.2方法　　1.2.1PCR引物的合成根據(jù)GenBank中相應(yīng)cDNA基因序列,自行設(shè)計(jì)引物,委托上海英駿生物有限公司合成,引物序列:P1:5′GTGTGGTGTAAAGGAATTCATT3′;P2:5′CGCGGATCCAGAAACTGGGAGCAAAGATA3′。　　1.2.2總RNA的提取及RTPCR擴(kuò)增在50μL反應(yīng)

7、體系中加入10×buffer5μL,10mmol/L,dNTP1μL,引物1、2各1μL,5U/μLTaq酶0.5μL,模板cDNA2μL,ddH2O40μL,計(jì)反應(yīng)體系50μL。PCR反應(yīng)條件為94℃5min,94℃30s,55℃30s,72℃45s,后3步反復(fù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用Uuiq10柱式DNA膠回收試劑盒提純?！　?.2.3野生型SNCA基因的TA克隆取膠回收產(chǎn)物7.5μL加入1μLTvector、1μL10×ligationbuffer、0.5μLT4DNAligase,混合為10μL連接反應(yīng)體系于4℃過(guò)夜。將10μL連接液與200

8、μL感受態(tài)細(xì)菌混勻,冰浴30min后于42℃水浴90s,置冰浴2m