脫氧核糖核酸(DNA)制備

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1、脫氧核糖核酸（DNA.）的制備王爾中（中國科學院動物研究所）在實驗生物學的研究中，DNA的制備已緩沖液中。成為一種常用的方法。根據(jù)實驗材料和研究目（二）非離子性乳化荊溶胞法［[t]的不同，所用的制備方法也不同。本文主要介此方法是用輕度溶胞法，可以使細菌細胞紹質粒DNA和其它（動物組織、細菌）DNA的染色體DNA仍然與細胞膜結合在一起，這常用的制備方法。樣就能在低速離心中將染色體DNA與質粒DNA分開。一、質粒DNA的制備非離子性乳化劑多氧乙烯十六烷醚（即Brij質拉(plasmid）是共價閉合環(huán)

2、狀的超螺旋58)，可以用來分離質粒DNA。通常所使用的DNA。它的堿基比例與染色體DNA不同，質蔗糖緩沖液和溶菌酶制備的細菌球形體，在脫粒DNA分子量小，而染色體DNA分子量大。氧膽酸鹽（DOC）和EDTA存在的情況下，加根據(jù)這些特點，研究人員采用一些實驗技術進人Brij58溶胞，在低速離心中絕大部分（90外）行提取純化。常用的方法有以下幾種。的染色體DNA會沉降下來，而質粒DNA保（一）Hirt改良法持在上清液中。因為脫氧膽酸鹽可以分解細胞此方法可以用來提取質粒DNA或分子量膜的脂蛋白或脂多糖

3、，因此質粒DNA可以與小的DNA（如噬菌體、病毒或線粒體DNA)o細胞膜分離。這一方法廣泛應用于分離質粒將細菌培養(yǎng)到3X105細胞／毫升濃度（590DNA與染色體DNA.ml‘處0·D約為0.6-0.8)040C,600g離心10（三）質粒DNA的提純方法分鐘收集菌體。然后重新懸浮于5倍體積的10一般地說，上述兩種方法分離的質粒DNAmMTris-HC1pH8.0,1mMLDTA緩沖液中。都比較粗放，需進一步純化。常用的純化方法輕輕搖動混合，加20毫克／毫升的鏈霉素蛋白酶有以下三種。K，使最終濃

4、度到50微克／毫升。然后再加10務1．兩相法［[2l的SDS，使最終濃度達1多。在37℃下保溫30分此方法是繼冷酚法抽提之后，用酒精沉淀鐘，然后慢慢加人4M氯化鈉，使最終濃度為出DNA（還包括各種RNA)。它是一種專門1M（此步驟必須邊加邊搖），混合均勻，再于4cC,提取閉合環(huán)狀雙鏈DNA的快速方法之一。放置過夜。過夜后，在40C,10000g離心30分在供試DNA懸液中加人少量IOmMTris-鐘，取上清液，加入等體積的三氯甲烷一異戊醇HCI,pH8.0,1mMEDTA緩沖液。在100℃加(2

5、4:1)混合液，再加入等體積90%的苯酚，00C熱2分鐘后，迅速放入干冰一酒精溶液中冷卻。下攪拌30分鐘，再置于40C,1500g離心10分然后加2-，倍體積的葡聚糖500(16.8多W/鐘。吸出水相層，加二倍體積冷乙醇(-20cC),W),1.25倍體積的聚乙二醇6000(18.4多W/于一20℃放置過夜。過夜后，在一100c,1oooogW）和十分之一體積的0.5M磷酸鈉緩沖液pH離心10分鐘。將沉淀溶于少量pH8.1的106.8,溫度保持在40C。然后再加水，使體積成.mMTris-HCI

6、,50mM氯化鈉、0.1mMEDTA為原體積的，倍。充分混勻，在4℃下低速離32心，回收含有過量聚乙二醇的上清液。加入氯中）。40C、勻漿3分鐘，1000g離心1，分鐘，棄化鈉，使最終濃度為0.2A1后，加二倍體積的酒去上清液（此步驟重復兩次）。沉淀加9毫升緩精，使DNA沉淀。沉淀用75多的酒精洗后，沖液，用磁力攪拌器攪勻，再加九分之一體積的溶解于緩沖溶液中。十二烷基硫酸鈉（簡稱SDS)，再將它溶解在2.硝酸纖維素濾膜吸附法W45%酒精里，室溫下輕微攪動一小時。緩慢加此方法主要是通過硝酸纖維素濾

7、膜使單鏈人5％的固態(tài)氯化鈉，并繼續(xù)在室溫下攪動，后染色體DNA與雙鏈質粒DNA分開，以達到于4℃放置過夜。過夜后4℃下3900叱離心二除去染色體DNA，純化質粒DNA的目的。小時。取上清液逐滴加入二倍體積的無水酒精經(jīng)適當條件修剪后，可以使染色體DNA（同時輕微攪拌），用玻璃棒卷起DNA纖維，然和質粒DNA混合物中的染色體DNA成為碎后用75酒精洗數(shù)次。片，而質粒DNA仍保持完整（因為質粒分子（二）染色體DNA的分離〔31量小）。如果這種切斷的染色體DNA和質粒收集細胞（2-3X10‘細胞／毫升）

8、，用冷的DNA受到高溫或PH大于11.，的處理，破壞亨克民平衡鹽溶液（BSS)清洗三次后，加人皂染色體片段雙鏈DNA之間的氫鍵，使雙鏈草貳(saponin)，使最終濃度為0.3多。靜置5分DNA變成單鏈DNA（即變性），而質粒DNA鐘后，再用BSS洗二次。懸浮于SSC（即0.5m因為呈閉合環(huán)狀，不會發(fā)生單鏈變性現(xiàn)象。依氯化鈉，0.015M檸檬酸鈉中），再加SDS，使?jié)鈸?jù)單鏈DNA可以被吸附在硝酸纖維素上，而度達0.2沁。雙鏈DNA不被吸附，這樣就可以使單鏈染色在澄清粘液中，加人核糖核酸酶A（即R