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《免疫增強(qiáng)劑對豬瘟疫苗免疫效果的影響-具體實(shí)驗(yàn)方案》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、具體實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)?zāi)康模罕驹囼?yàn)采用常規(guī)白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)、豬瘟抗體ELISA檢測對不同免疫條件下的仔豬進(jìn)行跟蹤檢測，觀察其白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)目變化情況、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能、CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞亞群及IFN-γ、IL-4的動態(tài)變化狀況，CSFV抗體水平變化規(guī)律，并與普通免疫組及對照組進(jìn)比較，分別從細(xì)胞和分子水平評價免疫增強(qiáng)劑復(fù)方植物多糖稀釋豬瘟疫苗的安全性及對機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的影響。實(shí)驗(yàn)方案：試驗(yàn)分組取20～25日齡未注射豬瘟疫苗的豬30頭，隨機(jī)分為A、B、C組。A組為強(qiáng)勉稀釋組、B組為強(qiáng)勉+
2、生理鹽水稀釋組、C組為生理鹽水稀釋組。實(shí)驗(yàn)方法：A組用強(qiáng)勉2ml稀釋豬瘟細(xì)胞苗3頭份；B組用生理鹽水1ml稀釋豬瘟細(xì)胞苗3頭份，然后加入強(qiáng)勉1ml；C組用2ml生理鹽水稀釋豬瘟細(xì)胞苗3頭份作為空白對照。表1“強(qiáng)勉”增強(qiáng)豬瘟疫苗免疫效果試驗(yàn)設(shè)計(jì)組別母源抗體試驗(yàn)豬頭數(shù)試驗(yàn)藥物添加量給藥方法給藥時間A+5強(qiáng)勉2ml/3頭份稀釋疫苗在接種當(dāng)日使用-5強(qiáng)勉2ml/3頭份稀釋疫苗在接種當(dāng)日使用B+5強(qiáng)勉+生理鹽水1ml+1ml/3頭份稀釋疫苗在接種當(dāng)日使用-5強(qiáng)勉+生理鹽水1ml+1ml/3頭份稀釋疫苗在接種當(dāng)日使用C+5生理鹽水2ml/3頭份稀
3、釋疫苗在接種當(dāng)日使用-5生理鹽水2ml/3頭份稀釋疫苗在接種當(dāng)日使用檢測指標(biāo)于注射疫苗的前3天，第3，第7天，14天，21天，60天分別采血檢測。（母源抗體檢測的基礎(chǔ)條件，首免時間？）白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類實(shí)驗(yàn)前腔靜脈無菌采血20mL，分別分為肝素抗凝血和非抗凝血兩份（2mL取血清——抗體檢測），取4mL用于分離淋巴細(xì)胞作淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞亞群及IFN-γ、IL-4的動態(tài)變化狀況；3mL用于上流式細(xì)胞儀檢測，剩余作白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)（通過血液分析儀白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)）。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)外周血淋巴細(xì)胞制備無菌采集
4、肝素抗凝血樣2mL/頭，加入等體積無ca2+Mg2+Hank’s液混勻，于7mL離心管中加入2mL淋巴細(xì)胞分離液，將稀釋的血液沿管壁緩緩加到分層液上，2000r/min離心20min，小豬血液離心時間根據(jù)分離情況適當(dāng)延長，取出，小心吸取位于第二層的白色淋巴細(xì)胞層，加入無Ca2+Mg2+Hank’s液至5mL，1000r/min離心10min，棄上清，重復(fù)洗滌兩次，第四次用完全RPMI-1640洗滌淋巴細(xì)胞。棄上清，用0.5mL完全RPMI-1640重懸淋巴細(xì)胞，取0.02mL計(jì)數(shù)，同時用臺盼蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞應(yīng)在95%以上，調(diào)整細(xì)胞濃度
5、為5xl06個/mL，留作備用。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化檢測取調(diào)整好細(xì)胞濃度的淋巴細(xì)胞懸液，用微量移液器輕輕吹打充分混勻后，向96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板上每孔加入l00uL的細(xì)胞液，實(shí)驗(yàn)組每孔加入100uL50ug/nL的PHA-P，對照組加入完全RPMI-1640，每個樣品設(shè)三個重復(fù)。置5%COZ培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)44h，再向各孔加入20uLMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，取出后小心吸凈上清液，每孔加入二甲基亞颯100uL溶解細(xì)胞，微型振蕩器震蕩混勻，避光放置10min，以570nm波長測得OD值。流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+/CD3+、CD8+/CD3+：取2
6、00uL肝素抗凝血，加入適量PBS混勻后1500r/min離心5min，棄去上清，沉淀中加入紅細(xì)胞裂解液3-4mL，充分混勻，室溫放置5min，1500r/min離心5min，重復(fù)2-3次，直到上清中見不到紅色為止，再用PBS洗滌兩次除去裂解液，加入適量的單克隆抗體，低速振蕩混勻5s，室溫避光靜止45min后，用PBS反復(fù)洗滌兩次，除去多余未標(biāo)記的單抗隆抗體，上流式細(xì)胞儀分析，每份血樣分三份分別檢測CD4+/CD3+、CD8+/CD3+.。細(xì)胞因子分泌的檢測：IFN-γ和IL-4夾心ELISA試劑盒檢測，具體參照試劑盒操作指南進(jìn)行嚴(yán)格
7、操作。CSFV血清抗體檢測：CSFV抗體ELISA檢測試劑盒檢測，具體參照試劑盒操作指南進(jìn)行嚴(yán)格操作。實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)預(yù)算淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)所需試劑及檢測費(fèi)用：2200元IFN-γ和IL-4夾心ELISA試劑盒及檢測費(fèi)用共計(jì)：3000元*2=6000元CSFV抗體檢測試劑盒及檢測費(fèi)用共計(jì)：3000元CD4+/CD3+、CD8+/CD3+檢測費(fèi)及儀器使用費(fèi)用共計(jì)：1800元以上共計(jì)：13000元。費(fèi)用出資問題藥品試劑：CFSE購自MolecularProbes公司刀豆蛋白A（ConA）、brefeldinA、皂莢素（saponin）
8、購自Sigma公司PE標(biāo)記的抗鼠IFN-γ或IL-4單抗購自BDPharmingen公司CellCountingKit-8購自同仁化學(xué)研究所IFN-γ和IL-4夾心ELISA試劑盒購自Biosource公司Ni柱購自GE
