曲霉菌發(fā)酵淀粉酶的分離純化和生化性質(zhì)的研究

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1、中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文曲霉菌發(fā)酵淀粉酶的分離純化和生化性質(zhì)的研究姓名：梁彬申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：張岐山20030401中文摘要前言消化酶制劑是我們?nèi)粘Ｉ畹谋貍渌?，主要用于治療消化不良，慢性胃病，也適合消化功能低下的老年人使用。每年我國對消化酶制劑的需求量很高。消化酶制劑的主要成分為淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶。目前，臨床上的所有消化酶制劑成分均為從豬、牛、羊等動物胰腺組織的提取物，雖然其來源容易，提取過程簡單，但是動物源性的生物材料還要對其進(jìn)行檢疫，防止人畜共患疾病的感染，建立取材動物健康檔案執(zhí)行起來較為困難。使用細(xì)菌發(fā)酵法生成的酶制備消化酶制劑，國內(nèi)

2、還沒有開展此項(xiàng)技術(shù)。本文應(yīng)用提純程序從細(xì)菌發(fā)酵物中純化其中一種酶～淀粉酶。細(xì)菌發(fā)酵淀粉酶屬于水解酶類，它是由精選的曲霉菌經(jīng)深層發(fā)酵而產(chǎn)生的。淀粉酶是一種常見酶，催化淀粉水解生成糊精和麥芽糖，過度反應(yīng)可以生成葡萄糖。淀粉酶幾乎存在于所有生物體內(nèi)，對于食物消化具有重要作用。最近Novozymes公司生產(chǎn)的多用于制酒業(yè)和制糖業(yè)工藝中的微生物發(fā)酵淀粉酶制品，純度低，不能達(dá)到醫(yī)藥級水平的純度。為了將微生物發(fā)酵淀粉酶應(yīng)用到多酶制劑中，需要選擇合適的方法對其進(jìn)行純化。本文研究從細(xì)菌發(fā)酵法制成的酶粗品中用簡單可行的方法提純淀粉酶，方法簡單，產(chǎn)量及純度高，適合大規(guī)模生產(chǎn)，并且對其生物化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究

3、，為后期的生產(chǎn)提供合適的條件。驗(yàn)材料曲霉菌發(fā)酵淀粉酶粗品(產(chǎn)地天津)；DEAE—Sephacel，Sepha-dexG75柱，丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺(Pharmaciabiotech產(chǎn)品)；NaCl，CaCl2，Na2HPO。，K82P04，啊s—Hcl等為化學(xué)純；淀粉酶試劑盒(上海長征試劑)、牛血清白蛋白(購自北京邦定泰克生物技術(shù)公司)實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果首先用DEAE—Sephacel柱層析對發(fā)酵淀粉酶粗品進(jìn)行分離純化，鹽離子濃度梯度洗脫，獲得10個峰，即得到10種組分，通過對10種組分進(jìn)行淀粉酶活力檢測和蛋白質(zhì)含量分析，選出一種淀粉酶含量高的峰進(jìn)行進(jìn)一步純化。對這一組分進(jìn)行處理后

4、，繼續(xù)過SephadexG75層析柱，經(jīng)鹽離子濃度梯度洗脫，并做淀粉酶活力檢測和蛋白質(zhì)含量分析，4個組分中只有一個具有較高的淀粉酶活力。酶活性得率為14．2％。SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳測定其純度和分子量：電極緩沖液為蹦s—Hcl緩沖液(pH8．3，25mmol／L)，分離膠緩沖液(pH8．8，3mol／L)，濃縮膠緩沖液(pH6．8，0．5mol／L)，考馬斯亮藍(lán)R-250染色，結(jié)果表明：此高淀粉酶活力組分為單一條帶，分子量為57000左右。淀粉酶的Km測定：用pH7．1的PIPES(pH7．1，0．1tool／L)緩沖液配制各種濃度的EPS(0．05、0．1、0．2、0．5、1

5、．0、2．0、2．5mmol／L)，取EPSl60『山與過SephadexG75后的樣品4m混合，再加人多功能的0【一葡萄糖苷酶(8KU／L)40l一，混合后用生化自動分析系統(tǒng)于37℃測定其吸光度的變化。延遲時間為120s，讀數(shù)時間為90s，波長為405nm，常數(shù)(F)為5150。用Lineweaver—Burk雙倒數(shù)作圖法計(jì)算Km，得到Kin為0．145mmol／L。pH對酶活力的影響：將酶液用不同pH的緩沖液溶解，pH4．9-8．8磷酸氫鉀一磷酸二氫鈉緩沖液，分別配制酶反應(yīng)體系，室溫下放置30分鐘，用常規(guī)方法測定酶活力，計(jì)算相對酶活性。結(jié)果·2·表明酶的最適pH為6．8—7．0

6、。pH穩(wěn)定性：把酶放在上述不同pH的緩沖液中，4。C過夜，用常規(guī)方法測定相對酶活性。結(jié)果表明酶在pH5．0—7．O范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，在此范圍內(nèi)活性損失比較小。溫度對酶活力的影響：將酶于不同溫度(20℃、30℃、40℃、45。C、50℃、60。C、70。E)下測定酶活力。結(jié)果表明酶的最適溫度為50～60℃。酶的熱穩(wěn)定性：將酶液在30"(2～90。C分別保溫lO分鐘、30分鐘和60分鐘，然后按常規(guī)方法測定酶活力，以最初的酶活力為100％。結(jié)果表明酶在60℃以下非常穩(wěn)定，保溫60分鐘酶活力基本不變。溫度在70℃以上酶活性喪失較快，80。E保溫10分鐘酶活性尚有65％左右；而90。C保溫10

7、分鐘酶活性已經(jīng)損失了60％；90℃保溫30—60分鐘酶活性損失90％左右。金屬離子和其它化合物對酶活力的影響：將各種化合物配成溶液與酶液混合，在室溫放置2小時，然后按常規(guī)方法測定酶的活力。實(shí)驗(yàn)表明Ca“、Mg“離子有微弱的激活作用，Cu“，co“、Fe2+、Fe3+有輕微的抑制作用，A13+、Pb2+、zn2+有明顯的抑制作用。討論微生物酶的分離純化歷來是酶學(xué)研究中最為重要同時也是最棘手的問題，尤其對分子量較大的酶更是如此，現(xiàn)在的微生物酶產(chǎn)品多用于洗滌制品、制酒業(yè)和制