紅曲霉生淀粉酶發(fā)酵優(yōu)化、分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究

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1、萬(wàn)方數(shù)據(jù)SichuanAgriculturalUniversityDissertationforMasterDegreeStudiesonfermentationoptimization，purificationandenzymecharacteristicsofraw--starch-·digestingamylasefromMonascusDirectorDisciplinesandSpecialtiesLiuBoFoodScienceResearchFieldFunctionalFoodJune，2014萬(wàn)方數(shù)

2、據(jù)論文獨(dú)創(chuàng)性聲明～I(xiàn)遼IlUl鯽lIIIIIJl2lWll211711119111本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行研究工作所取得的成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，學(xué)位論文中不包含其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也不包含為獲得四川農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)所使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。研究生簽名：融；良加圩年∥月7R關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解四川農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：

3、學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意四川農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。f劇本論文不保密?？诒菊撐谋Ｃ?，在一年解密后適用本授權(quán)。(請(qǐng)?jiān)谝陨峡趦?nèi)劃“4”)研究生簽名：瀏釓導(dǎo)師簽名：匆互必多p互必2口J午年‘月c『El加忤年6月c}El萬(wàn)方數(shù)據(jù)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)2011級(jí)碩士學(xué)位論文摘要生淀粉酶是指能對(duì)不經(jīng)過(guò)蒸煮糊化的生淀粉顆粒能夠表現(xiàn)出強(qiáng)水解活性的酶類。由于生淀粉酶能將未經(jīng)蒸煮糊化的生

4、淀粉直接轉(zhuǎn)化成葡萄糖等可發(fā)酵性糖供微生物生長(zhǎng)與代謝，其比傳統(tǒng)的高溫蒸煮糖化節(jié)約25％--30％的能耗。正是由于生淀粉酶具有的潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值和某些特殊用途，因此一直受到國(guó)內(nèi)外許多研究人員的關(guān)注。本課題從生淀粉酶產(chǎn)生菌MonascusM2為出發(fā)菌株，通過(guò)發(fā)酵條件和培養(yǎng)基優(yōu)化，使菌株的產(chǎn)酶能力進(jìn)一步提高，對(duì)所產(chǎn)的粗酶液進(jìn)行了分離純化，并對(duì)純化后酶液的部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。其主要研究結(jié)果如下：(1)對(duì)紅曲霉M2產(chǎn)生淀粉酶的固態(tài)發(fā)酵進(jìn)行了優(yōu)化。對(duì)固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果表明：溫度為32。C，pH值5．0，無(wú)機(jī)鹽水量為14mL

5、，培養(yǎng)時(shí)間8d時(shí)，在該條件下可得到紅曲霉M2產(chǎn)生淀粉酶的最大酶活：445．37U／g。培養(yǎng)基優(yōu)化單因素結(jié)果表明：最適碳源為乳糖，氮源為州H4)2S04，最適無(wú)機(jī)鹽為K2HP04，進(jìn)一步通過(guò)Box．Bohnken中心組成實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析，最終確定適宜的培養(yǎng)基條件為：乳糖添加量為1．809、(NH4)2S04添加量為1．409、K2HP04添加量為0．29。預(yù)測(cè)值為680．29U／g，在以上優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，得到生淀粉酶酶活為662．21U／g。(2)紅曲霉M2固態(tài)發(fā)酵成熟曲經(jīng)水浸提、硫酸銨鹽析、

6、DEAE．Sepharosefastflow陰離子交換層析、SephacrylS-200凝膠過(guò)濾層析等提純步驟，獲得了比酶活396．61U／mg蛋白的生淀粉酶、純化倍數(shù)為6．86、回收率為12．70％。其Tricine—SDS—PAGE呈單一條帶。用Tricine—SDS-PAGE測(cè)得生淀粉酶的相對(duì)分子質(zhì)量約為67．81kD。(3)對(duì)純化后的紅曲霉生淀粉酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究，試驗(yàn)結(jié)果表明：最適作用溫度為50。C，60℃保溫2h仍可以保持近70％的酶活力，最適作用pH為5．0，在pH3．0—7．0的環(huán)境條件下保溫30m

7、in仍可以保持60％以上的酶活力。以生玉米淀粉為底物的酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和Vma)【值分別為14．96mg．mlJ和10．79mg·mL～·min～；Mn2+、Ca2+、Ba2+對(duì)酶有激活作用，而Na+、K+、M92+、Zn2+對(duì)酶基本無(wú)影響，F(xiàn)e3+對(duì)酶有強(qiáng)烈的抑制作用。L．半胱氨酸對(duì)該酶有促進(jìn)作用，SDS、DMSO、DTT和B一巰基乙醇對(duì)酶活基本無(wú)影響，EDTA和EGTA能較弱抑制該酶的酶活力，而PMSF、KMn04、氯胺T和TritonX．100則能強(qiáng)烈抑制生淀粉酶的酶活。萬(wàn)方數(shù)據(jù)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)201l級(jí)碩士學(xué)位論

8、文綜上所述，本研究通過(guò)固態(tài)發(fā)酵提高了MonascusM2產(chǎn)生淀粉酶的能力，其所產(chǎn)生的生淀粉酶在實(shí)驗(yàn)條件下不僅具有極強(qiáng)的pH穩(wěn)定性，而且還能適應(yīng)較寬的pH范圍。與此同時(shí)大多數(shù)金屬離子和化學(xué)物質(zhì)對(duì)該酶的影響不大，因此具有較高的理論和實(shí)用價(jià)值。關(guān)鍵詞：紅曲霉；生淀粉酶；發(fā)酵優(yōu)化；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)Il萬(wàn)方數(shù)據(jù)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)2011級(jí)碩士學(xué)位論文Abst