黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶

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1、黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶前言：α-淀粉酶能隨機(jī)地作用于淀粉的非還原端，生成麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，所得產(chǎn)物的還原性末端葡萄糖單位碳原子為α構(gòu)型，同時(shí)該酶能使淀粉漿的粘度下降，因此又稱為液化酶。耐酸性α-淀粉酶是在酸性條件下水解淀粉的酶類，其最適pH在4.0左右。自從日本研究者YasujiMinoda等人用黑曲霉生產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶以來(lái)，各國(guó)都對(duì)耐酸性α-淀粉酶進(jìn)行了研究。通過(guò)黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，熟悉發(fā)酵罐的構(gòu)造和使用方法。初步了解發(fā)酵生產(chǎn)的原理和常規(guī)發(fā)酵參數(shù)的檢測(cè)方法。整個(gè)實(shí)驗(yàn)按照“菌種的培養(yǎng)空消實(shí)消接

2、種發(fā)酵放罐”的發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行。在整個(gè)發(fā)酵的過(guò)程中，每隔6h取一次發(fā)酵液樣品檢測(cè)其pH值、酶活、殘?zhí)橇考吧锪克膫€(gè)生理指標(biāo)。最后將所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析，可以得出整個(gè)發(fā)酵過(guò)程各物質(zhì)的生成和消耗的變化規(guī)律以及如何調(diào)整培養(yǎng)條件來(lái)提高發(fā)酵生產(chǎn)的效率，對(duì)大工業(yè)生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。正文：一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．了解發(fā)酵罐的幾大系統(tǒng)組成，即空氣系統(tǒng)、蒸汽系統(tǒng)、補(bǔ)料系統(tǒng)、進(jìn)出料系統(tǒng)、溫度系統(tǒng)、在線控制系統(tǒng)。2．掌握發(fā)酵罐空消的具體方法及步驟3．掌握發(fā)酵罐進(jìn)料及實(shí)消的具體方法及步驟4．掌握發(fā)酵罐各系統(tǒng)的控制操作方法二、實(shí)驗(yàn)原理1.蒸汽系統(tǒng)：蒸汽發(fā)生器

3、：主要用于滅菌，分為自動(dòng)加水和手動(dòng)加水兩種方式。2.溫度系統(tǒng)：(1)夾套升溫：蒸汽通入夾套。(2)夾套降溫：冷水通入夾套，下進(jìn)水，上出水。(3)發(fā)酵過(guò)程自動(dòng)控溫系統(tǒng)3.空氣系統(tǒng)：空氣除菌設(shè)備：空壓機(jī)貯氣罐油水分離器空氣流量計(jì)空氣過(guò)濾器發(fā)酵罐4.補(bǔ)料系統(tǒng)：補(bǔ)加培養(yǎng)基、消泡劑、酸堿等。5.在線控制系統(tǒng)6.進(jìn)出料系統(tǒng)：進(jìn)料口（接種口）、出料口（取樣口）7.管道：包括水流通管道和氣流通管道7水流通：冷卻用水：水經(jīng)過(guò)進(jìn)水管道發(fā)酵罐夾套出水口保溫用水：關(guān)閉進(jìn)出水管道閥門（水注滿后）加熱保溫進(jìn)入夾套氣流通：蒸汽發(fā)生器蒸汽管道空氣過(guò)濾器/發(fā)酵

4、罐進(jìn)入罐內(nèi)空氣：空壓機(jī)貯氣罐油水分離器空氣流量計(jì)空氣過(guò)濾器發(fā)酵罐三·方法與注意事項(xiàng)㈠原則1.通蒸汽前先關(guān)閉所有閥門2．粗過(guò)濾器不空消也不實(shí)消，要定期處理，所以必須關(guān)閉通向粗過(guò)濾器的閥門。3．活蒸汽，滅過(guò)頭，即尾汽不能關(guān)死，要保證有活蒸汽放出，但不能太大，以免分壓。4．罐體排汽口排汽，并保持罐內(nèi)正壓。5．空氣過(guò)濾系統(tǒng)只空消，不實(shí)消，以免罐中物料沖入過(guò)濾器內(nèi)。但空消一結(jié)束，即要通入無(wú)菌空氣吹干管路并保壓，避免染菌。6．進(jìn)蒸汽時(shí)順著蒸汽管路開閥門，結(jié)束時(shí)逆著進(jìn)路關(guān)閥門，先開尾閥后開主閥，結(jié)束時(shí)先關(guān)主閥后關(guān)尾閥。8．蒸汽一停，即由無(wú)菌

5、空氣充入保持罐內(nèi)正壓。㈡空消先開啟蒸汽發(fā)生器，自有蒸汽產(chǎn)生并排掉管路中冷凝水后，按以下步驟進(jìn)行：1．先關(guān)閉所有閥門，檢查處是否關(guān)緊密封，打開罐上方排氣口。2．蒸汽先進(jìn)空氣系統(tǒng)，蒸汽→蒸汽過(guò)濾器→分過(guò)濾器，無(wú)論蒸汽走到哪一路得先放尾閥，放出冷凝水，排掉冷空氣，待有蒸汽沖出后調(diào)小，打開主閥。3．再進(jìn)罐體：由主路進(jìn)罐，然后通入取料管路，再入補(bǔ)料系統(tǒng)（兩邊）。4．罐壓升至所需溫度（121℃）時(shí)開始計(jì)時(shí)，保溫保壓30min。保壓方式：（1）調(diào)節(jié)主汽路進(jìn)汽閥門控制進(jìn)汽量；（2）調(diào)節(jié)排氣口排氣量大小或尾閥放汽量。5．結(jié)束空消：（1）逆著蒸汽

6、進(jìn)路關(guān)，先關(guān)近罐閥。（2）同時(shí)準(zhǔn)備好壓縮空氣確保蒸汽一停即充入無(wú)菌壓縮空氣以維持空氣系統(tǒng)及罐內(nèi)的正壓。近罐空氣閥的尾閥要一直微開啟。注意：空消前應(yīng)檢查夾套中是否殘留了冷水，若有，影響罐體升溫，須自?shī)A套出水口將水放出。㈢種子制備：接種黑曲霉于PDA液體培養(yǎng)基中，液體搖瓶培養(yǎng)。㈣培養(yǎng)基配制、實(shí)消發(fā)酵培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉200g，檸檬酸氫二銨100g，KH2PO415g，CaCl20.5g，F(xiàn)eSO4.7H2O0.05g，MgSO4.7H2O0.5g，加水定容至5L，pH5.0，消泡劑（植物油）5mL。7關(guān)閉氣路入罐閥，主汽路進(jìn)汽

7、→補(bǔ)料口進(jìn)汽（方法同空消）→罐壓升至0.12Mpa（121℃），保壓、保溫30分鐘→實(shí)消結(jié)束。㈤冷卻接種與發(fā)酵待培養(yǎng)基冷卻至28℃左右時(shí)，在加料口周圍放一圈酒精棉球，點(diǎn)燃，在無(wú)菌條件下打開進(jìn)料口，迅速接種。將溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量等參數(shù)設(shè)定好后，進(jìn)行發(fā)酵。㈥參數(shù)監(jiān)測(cè)每隔6h取一次樣，檢測(cè)其pH、生物量、酶活及殘?zhí)呛康戎笜?biāo)。Ⅰ.pH的測(cè)定：標(biāo)準(zhǔn)液校準(zhǔn)pH計(jì)后，測(cè)定樣品pH值。Ⅱ.生物量的測(cè)定：每次取20-30mL的發(fā)酵液，先用大離心機(jī)(5000rpm,3-5min)離心，收集上清液用來(lái)測(cè)酶活，沉淀用水清洗幾次后再離心，然后將所

8、得沉淀放入100℃烘箱中，烘干（2h左右），然后測(cè)其干重，取平均值。Ⅲ.酶活：試劑：（1）碘液：稱取0.5gI2和5.0gKI研磨溶解于少量蒸餾水，定容至100ml，于褐色試劑瓶?jī)?nèi)保存，避免陽(yáng)光直射。（2）稀碘液：取原碘液1ml稀釋100倍。此溶液現(xiàn)配現(xiàn)用（3）0.5%淀粉液