NK細胞活化性受體NKp30的表達與功能研究

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1、作者姓名：學科專業(yè)：導師姓名：完成時間：王宏偉細胞生物學孫、衲教授二O一一年五月UniversityofScienceandTechnologyofChinaAdissertationfordoctor’SdegreeExpressionandFunctionalResearchofActivatingReceptorNKp30onNKcellsAuthor’SName：●●-speciality：一●Superwsor：11●●tlnishedtime：HongweiWangCellbiologyProf．RuiSunMay,2011—。。_——中國科學技術(shù)大學學位論文原創(chuàng)性聲明本人聲明

2、所呈交的學位論文，是本人在導師指導下進行研究工作所取得的成果。除已特，l,J)JI以標注和致謝的地方外，論文中不包含任何他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同工作的同志對本研究所做的貢獻均已在論文中作了明確的說明。作者簽名：釁簽字日期：!!!-鳥i鈺中國科學技術(shù)大學學位論文授權(quán)使用聲明作為申請學位的條件之一，學位論文著作權(quán)擁有者授權(quán)中國科學技術(shù)大學擁有學位論文的部分使用權(quán)，即：學校有權(quán)按有關(guān)規(guī)定向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復印件和電子版，允許論文被查閱和借閱，可以將學位論文編入《中國學位論文全文數(shù)據(jù)庫》等有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。本人提交

3、的電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。保密的學位論文在解密后也遵守此規(guī)定。弋壓開口保密!——年)作者躲墨醴簽字日期：』至!』上6-矛導師簽名：簽字日期：皇!!!：堡：星。。。。。?！逃忻庖?innateimmunity)是生物體在物種進化過程巾形成的··系列防御機制，能迅速的對侵入的病原體產(chǎn)生非特異性抗感染免疫應答，同時固有免疫在適應性免疫應答過程中也起著重要作用。天然殺傷細胞(naturalkillercells．NK)是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在機體防御病原微生物感染和抗腫瘤方面發(fā)揮著重要的作用。NK細胞的活化受其表面活化性與抑制性受體的協(xié)同調(diào)控，自然細胞毒性受體(n

4、aturalcytotoxicityreceptors，NCRs)是NK細胞特有的活化性受體，通常在NK細胞表面抑制性受體喪失識別“自我”能力時，發(fā)揮殺傷作用。NKp30(NCR3)是NCR家族的?個重要成員，表達于所有NK細胞表面，在NK細胞活化以及殺傷腫痛的過程中發(fā)揮重要作用，近幾年研究表明，NKp30分子參與NK細胞與樹突狀細胞(dendriticcells，DC)的交互調(diào)節(jié)(crosstalk)，實現(xiàn)對固有免疫和適應性免疫的調(diào)控。NKp30分子的功能在過去lO年里得到了研究者廣泛的關(guān)注，但NKp30分子在NK細胞的活化及免疫突觸形成中的確切作用機制尚不清楚。本研究中，我們構(gòu)建了人N

5、Kp30胞外段結(jié)構(gòu)域原核細胞表達載體，獄得有生物學活性的NKp30重組蛋白。我們采用NKp30重組蛋白免疫小鼠，制備了抗NKp30的單克隆抗體。我們利用免疫熒光、51Cr同位素釋放實驗、流式細胞術(shù)(FACS)和免疫印跡(Westernblotting)實驗對NKp30分子存NK細胞活化及NK細胞免疫突觸形成中的作用進行了研究。主要取得了以下結(jié)果：。1，NKp30分子胞外段結(jié)構(gòu)域蛋白的表達與純化構(gòu)建NKp30胞外段結(jié)構(gòu)域蛋白的原核細胞重組表達載體，通過誘導表達，重組蛋白以包涵體形式存在，經(jīng)過Westernblotting$1]質(zhì)譜鑒定，目的蛋白為人NKp30重組蛋白(簡稱rhNKp30)。分

6、別采片j稀釋復性法和鎳柱親和層析法對rhNKp30進行復性和純化，蛋白純度可以達到95％以上。經(jīng)FACS檢測rhNKp30能夠與NKp30配體陽性細胞結(jié)合，51Cr釋放實驗結(jié)果顯示rhNKp30能夠抑制NK92細胞對Hela細胞的殺傷。結(jié)果提；；j÷rhNKp30具有生物學活性，可用于功能研究。2，抗人NKp30單克隆抗體的制備、鑒定及應用用rhNKp30免疫8．10周齡的BALB／c雌性小鼠，采取不同的免疫策略，經(jīng)過5次免疫后，取小鼠的脾臟細胞與骨髓瘤SP2／0細胞在聚乙二醇作用’卜．進行體外融合。通過有限稀釋法和間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)篩選陽性雜交瘤細胞株，共狹得T4株能穩(wěn)定

7、分泌抗rhNKp30的單克隆抗體雜交瘤細胞株。我們選擇了其中對NKp30親和力高的克隆號為3G5的單克隆抗體進行了深入研究。常規(guī)方法制摘要備腹水，經(jīng)ProteinG親和層析法純化獲得純度為95％的單克降抗體3G5，并對該抗體進行了特性鑒定和應用檢測。單克隆抗體3G5n?匕廣泛用于Westernblotting、免疫沉淀(1mmunoprecipitation)、ELISA和FACS檢測實驗，并月．單克隆抗體3G5彳i影n