《電泳技術》課件

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1、電泳技術目錄第一節(jié)區(qū)帶電泳第二節(jié)等電聚焦電泳第三節(jié)SDS-PAGE電泳第四節(jié)二維電泳第五節(jié)印跡技術第六節(jié)免疫電泳第七節(jié)高效毛細管電泳技術第八節(jié)電泳分析儀基本原理不同性質的質點，由于帶電性質及電量不同，在一定電場強度下移動的方向和速度亦不同。蛋白質分子為兩性電解質等電點pH>等電點帶負電pH<等電點帶正電質點所帶凈電荷量越多（介質的pH值離等電點越遠）質點的直徑越小越接近球形則它在電場中的泳動速度越快，遷移率亦越大?；驹韰^(qū)帶電泳檢驗醫(yī)學中的應用－－血清蛋白電泳圖6-1正常血清蛋白電泳圖譜上圖：箭頭示電泳方向，右側示各條

2、帶的主要組分；下圖：光密度掃描后電泳圖譜；HP：觸珠蛋白；CP：銅藍蛋白Alb：清蛋白α1：α1酸性糖蛋白、α1抗胰蛋白酶α2：HP、CP、α2巨球蛋白、α脂蛋白β：運鐵蛋白、補體系統(tǒng)、β脂蛋白γ：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE區(qū)帶電泳圖6-2幾種常見異常血清蛋白圖譜A：雙清蛋白血清電泳圖；B：慢性肝病或肝硬變常見的?-?融合的橋連現(xiàn)象；C：免疫球蛋白寡克隆增生型；D：M蛋白血清型（IgA型）；N：正常對照血清；P：患者血清ABCD區(qū)帶電泳檢驗醫(yī)學中的應用－－同工酶電泳圖6-3LDH同工酶區(qū)帶電泳圖譜左：5份血清

3、iso-LDH電泳圖；右：iso-LDH電泳示意圖第一節(jié)區(qū)帶電泳檢驗醫(yī)學中的應用－－同工酶電泳圖6-4CK同工酶示意圖左：血清iso-CK電泳圖，3示正常血清（CKMB<5%），1、2、4示急性心梗（CKMB>5%）；4示CKBB陽性；右：iso-CK電泳圖譜示意圖區(qū)帶電泳實驗原理讓pH>pI（max）所有蛋白質帶負電各種蛋白質帶電量不同電泳速度不同經(jīng)過一段時間電泳后，各種蛋白質被區(qū)分開區(qū)帶電泳圖6-1正常血清蛋白電泳圖譜上圖：箭頭示電泳方向，右側示各條帶的主要組分；下圖：光密度掃描后電泳圖譜；HP：觸珠蛋白；CP：銅藍

4、蛋白Alb：清蛋白α1：α1酸性糖蛋白、α1抗胰蛋白酶α2：HP、CP、α2巨球蛋白、α脂蛋白β：運鐵蛋白、補體系統(tǒng)、β脂蛋白γ：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE第二節(jié)等電聚焦電泳檢驗醫(yī)學中的應用－－次級同工酶的分離圖6-5堿性磷酸酶同工酶等電聚焦電泳圖譜左：iso-ALP等電聚焦示意圖；右：膽道梗阻性疾病iso-ALP電泳圖譜第二節(jié)等電聚焦電泳區(qū)帶電泳的原理是不同的蛋白質有不同的電泳速度那么可不可以有另外一種方法：使得不同蛋白質在泳道中本來就有“固定”位置，蛋白質在相應的位置上停留？蛋白質如何能夠停止電泳？除了切

5、斷電源之外？蛋白質不帶電了——蛋白質處于等電點溶液中第二節(jié)等電聚焦電泳基本原理在等電聚焦電泳時必須有一個穩(wěn)定的pH梯度介質，使pH值從正極向負極漸次增加，形成一線性pH梯度。蛋白質混合物加入有pH梯度的電泳管中，在電場中經(jīng)一定時間后，混合物中各組分將分別聚焦在與各等電點相應的pH介質區(qū)域，形成分離的各種蛋白質區(qū)帶。這就是等電聚焦電泳分離蛋白質的基本原理。第三節(jié)SDS-PAGE電泳等電聚焦根據(jù)等電點將蛋白質分離那還能不能根據(jù)其他性質將蛋白質分離?區(qū)帶電泳的電泳速度的影響條件較多（大小、電荷、形狀），不是根據(jù)單一性質分離有一

6、種方法能根據(jù)蛋白質的分子量使之帶上相應的電荷，遠遠大于蛋白質本身電荷的大小，并使電荷成為電泳速度的主要決定因素，那么電泳速度只和分子量相關第三節(jié)SDS-PAGE電泳SDS是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質負載了大量負電荷，大大超過了天然蛋白質的原有電荷，因此蛋白質之間原有電荷的差異就無顯著效應，蛋白質帶電量的多少，只與蛋白質大小即分子量有關，此時，不同泳動速率僅反映了各蛋白質亞基的分子量的差別。第三節(jié)SDS-PAGE電泳檢驗醫(yī)學中的應用－－非濃縮尿蛋白電泳圖6-7非濃縮尿蛋白電泳示意圖第三節(jié)SDS-PAGE電泳檢驗醫(yī)學中

7、的應用－－非濃縮尿蛋白電泳圖6-8臨床常見蛋白尿電泳圖譜左：腎小球性蛋白尿；中：腎小管性蛋白尿，泳道4示混合性蛋白尿，腎小管性蛋白尿為主型；右：混合型蛋白尿一個條帶中仍是混合著多種蛋白質，如何再把它們分開呢？第四節(jié)二維電泳圖6-9二維電泳原理及流程圖第四節(jié)二維電泳基本原理第一維電泳，即等電聚焦電泳(isoelectricfocusing，IEF)其基本原理是利用蛋白質分子等電點的不同對其進行分離；第二維電泳，即SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，使電泳遷移率主要取決于蛋白質或亞基分子量的大小。第四節(jié)二維電泳檢

8、驗醫(yī)學中的應用一個問題：如何確定某個條帶是什么蛋白質？圖6-1正常血清蛋白電泳圖譜上圖：箭頭示電泳方向，右側示各條帶的主要組分；下圖：光密度掃描后電泳圖譜；HP：觸珠蛋白；CP：銅藍蛋白第五節(jié)印跡技術免疫印跡法－－基本原理圖6-13免疫印跡法的原理第五節(jié)印跡技術免疫印跡法（Immunoblotting）又稱蛋白質印跡