《蛋白質(zhì)分離、純化》PPT課件

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1、第七章蛋白質(zhì)的分離、純化蛋白質(zhì)分離、純化主要依據(jù)（1）蛋白質(zhì)的分子大小透析、超濾、分子篩層析（2）蛋白質(zhì)的帶電特性等電點(diǎn)沉淀、離子交換層析、等電聚焦電泳（3）蛋白質(zhì)的溶解特性硫酸銨分級沉淀、有機(jī)溶劑分級分離（一）材料1、選材2、破碎3、混合物的分離（二）粗分級（三）細(xì)分級采用簡單的實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，比如鹽析、等電點(diǎn)沉淀、透析、超速離心等對蛋白質(zhì)粗提取液進(jìn)行初步分離純化，經(jīng)濃縮后得到蛋白質(zhì)粗制品。蛋白質(zhì)粗分級一、鹽析鹽析：蛋白質(zhì)在高濃度中性鹽溶液中會沉淀析出。常用硫酸銨進(jìn)行沉淀。分級沉淀：通過調(diào)節(jié)硫酸銨的濃度可以使不同的蛋白質(zhì)分階段沉淀下來。優(yōu)點(diǎn)：價格便宜、蛋白質(zhì)沉淀

2、完全、溶解過程發(fā)熱少等。不足：沉淀后蛋白質(zhì)中含有大量硫酸銨，對后續(xù)純化過程產(chǎn)生不良影響。二、有機(jī)溶劑分級沉淀有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等（保持低溫），能破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)的溶解度降低而沉淀。優(yōu)點(diǎn)：蛋白質(zhì)沉淀不用脫鹽、有機(jī)溶劑去除容易。缺點(diǎn)：容易引起蛋白質(zhì)分子的變性，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格低溫。三、超速離心法在強(qiáng)大的離心力的作用下，溶液中的不溶解的顆粒狀物質(zhì)會沉淀析出，從而使溶液和沉淀物質(zhì)分開。四、等電點(diǎn)沉淀法在一定的pH條件下，蛋白質(zhì)所帶的凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。該法適用于在等電點(diǎn)pH穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。Protein的等電點(diǎn)（PI

3、）1、定義：使蛋白質(zhì)分子所帶正電荷與負(fù)電荷相等，即凈電荷為零時的溶液的pH值稱為PI(isoelectricpoint).2、當(dāng)pH值>PI時，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷當(dāng)pH值

4、聚焦電泳等進(jìn)一步對蛋白質(zhì)粗制品分離純化，以獲得高純度的蛋白質(zhì)樣品，用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能及其應(yīng)用研究。蛋白質(zhì)細(xì)分級一、凝膠層析又叫分子篩層析。分子篩是具有三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，有天然的，也可人工合成。根據(jù)網(wǎng)孔不同可制成不同規(guī)格。凝膠層析原理：1、分子量大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部，隨洗脫液從凝膠粒子之間的空隙擠落下來，所以大分子物質(zhì)遷移速度快；2、小分子物質(zhì)要通過凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部，所以小分子物質(zhì)遷移速度慢。具備條件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。常用分子篩：葡聚糖凝膠（Sephadex）型號：G200、G150、G100、G75、G50、G25、G1

5、5分離大蛋白質(zhì)、小蛋白質(zhì)，除鹽瓊脂糖凝膠（瑞典Sepharose、美國Bio-GelA）孔徑大，用于分離大分子物質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠（Bio-GelP）帶網(wǎng)孔的葡聚糖珠小分子進(jìn)入葡聚糖珠內(nèi)大分子不能進(jìn)入珠內(nèi)，經(jīng)珠之間縫隙流出凝膠過濾層析過程示意圖凝膠的前處理溶脹：稱取適量凝膠干粉，用約10倍蒸餾水浸泡24小時以上，待凝膠充分溶脹后，傾去上層懸浮物及蒸餾水。堿洗：用0.5MNaOH溶液浸泡半個小時，然后用蒸餾水洗至中性。酸洗：用0.5MHCl溶液浸泡半個小時，然后用蒸餾水洗至中性。平衡：用起始緩沖液浸泡凝膠，直至凝膠液pH與起始緩沖液相同。1.將層析柱垂直固定，加入適

6、量溶劑排走空氣。2.將平衡好的凝膠攪勻，連續(xù)傾入柱中，待其自然沉降至1/4~1/3高時打開下端出口，讓溶劑慢慢流出，繼續(xù)侵入凝膠至沉降到所需高度。裝柱時要注意操作壓。3.用3-5倍柱床體積的起始緩沖液走柱，使交換劑充分平衡，柱床穩(wěn)定。裝柱樣品上柱、洗脫、收集1.如圖裝好層析裝置，打開下端出口，使溶液流出至剛好達(dá)到凝膠膠面2.沿柱壁緩慢加入2ml樣品，打開下端出口，使樣品溶液流出至剛好達(dá)到凝膠膠面，再取少量起始緩沖液洗滌柱壁。3.打開起始緩沖液閥門，連續(xù)洗脫。4.用自動部分收集器自動或手動收集，合并同一高峰各管。凝膠的再生及保存再生用過的凝膠經(jīng)0.5M的NaOH和

7、HCl溶液分別處理后可以恢復(fù)其性能凝膠的保存方法0.02%疊氮鈉或0.002%雙氯苯雙胍己烷二、離子交換層析蛋白質(zhì)是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白質(zhì)也存在等電點(diǎn)（pI），蛋白質(zhì)在溶液中帶電狀況同氨基酸相同，取決于所處溶液的pH值。當(dāng)pIpH時，蛋白質(zhì)帶凈正電荷。注意：陽離子交換劑本身帶負(fù)電荷，陰離子交換劑本身帶正電荷。離子交換層析可分為陽離子交換與陰離子交換。1、樹脂類：分離氨基酸，孔徑??；2、纖維素類：分離蛋白質(zhì)，孔徑大。通過改變鹽濃度，輔助改變pH值進(jìn)行梯度洗脫。陽離子交換層析過程離子交換樹脂蛋白質(zhì)低離子強(qiáng)度洗脫液洗

8、高離子強(qiáng)度洗脫液洗加樣平