《蛋白質(zhì)的分離純化》PPT課件

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1、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及分離純化第一節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)第二節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化第三節(jié)蛋白質(zhì)的分子量測(cè)定第四節(jié)蛋白質(zhì)的含量測(cè)定與純度鑒定第一節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)二、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì)四、蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性五、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)和沉淀一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)在某pH時(shí)蛋白質(zhì)所帶正電荷與負(fù)電荷恰好相等，即蛋白質(zhì)的凈電荷為零時(shí)的pH稱等電點(diǎn)（pI）。沒(méi)有其他鹽類干擾時(shí),蛋白質(zhì)質(zhì)子供體基團(tuán)解離出來(lái)的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體基團(tuán)結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時(shí)的pH稱為等離子點(diǎn)。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)：蛋白質(zhì)等離子點(diǎn)：二、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì)蛋白質(zhì)溶液能吸收一定波長(zhǎng)的紫外光，主要是由帶芳香環(huán)

2、的氨基酸決定的。其在280nm處對(duì)紫外吸收能力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋荷═rp）>酪（Tyr）>苯丙（Phe）三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)和沉淀蛋白質(zhì)的分子大小屬于膠體質(zhì)點(diǎn)的范圍。蛋白質(zhì)溶液是一種穩(wěn)定的親水膠體（具有水化層和雙電子層）。蛋白質(zhì)溶液具有膠體的一般性質(zhì)：布朗運(yùn)動(dòng)、丁達(dá)爾效應(yīng)以及不能通過(guò)半透膜。半透膜：多是由用賽咯吩（cellophane）制造，賽咯吩膜是半通透的膜，蛋白質(zhì)等大分子不能透過(guò)膜，但小分子可以透過(guò)。（一）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)（二）蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)在溶液中的穩(wěn)定性是有條件的、相對(duì)的。如果條件發(fā)生改變,破壞了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中沉淀出來(lái)。蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性與質(zhì)

3、點(diǎn)大小、電荷和水化作用有關(guān),那么任何影響這些條件的因素都會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。沉淀蛋白質(zhì)的方法有以下幾種:中性鹽沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、重金屬鹽沉淀法、生物堿試劑和某些酸類沉淀法、加熱變性沉淀法.鹽析：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽(如：硫酸銨,硫酸鈉或氯化鈉等),使蛋白質(zhì)表面的電荷被中和，蛋白質(zhì)分子脫去水化層而聚集沉淀。1.中性鹽沉淀法（鹽析法）注意：鹽析一般不引起蛋白質(zhì)變性。當(dāng)除去鹽后,蛋白質(zhì)又可溶解。2.有機(jī)溶劑沉淀法向蛋白質(zhì)溶液中加入一定量的極性有機(jī)溶劑(如甲醇,乙醇或丙酮等)引起蛋白質(zhì)脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用，致使蛋白質(zhì)顆粒容易凝聚而沉

4、淀。3.重金屬鹽沉淀法當(dāng)溶液pH大于等電點(diǎn)（pI）時(shí),蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，這樣它就容易與重金屬離子(Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等)結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。應(yīng)用：誤服重金屬鹽的病人可口服大量牛乳或豆?jié){等蛋白質(zhì)進(jìn)行解救,然后再服用催吐劑排出體外。4.生物堿試劑和某些酸類沉淀法生物堿試劑是指能引起生物堿沉淀的一類試劑：如：鞣酸（單寧酸,tannicacid)鎢酸(tungsticacid，H2WO4)、苦味酸(picricacid)即2,4,6-三硝基酚,碘化鉀等。某些酸類:三氯醋酸,磺基水楊酸（sulfosalicylicacid）和硝酸等.當(dāng)pH

5、與生物堿試劑某些酸根負(fù)離子不溶性沉淀反應(yīng)5.加熱變性沉淀法幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí),加熱凝固最完全和最迅速。加熱變性引起蛋白質(zhì)凝固的原因：可能是由于熱變性使蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，因而破壞了水化層，同時(shí)由于蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)也破壞了帶電狀態(tài)。四、蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性蛋白質(zhì)變性的定義：環(huán)境的變化或是化學(xué)處理都會(huì)引起蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的破壞，并伴隨著生物活性的喪失、溶解度的降低以及其它理化常數(shù)的改變，這一過(guò)程稱為蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)的復(fù)性：蛋白質(zhì)的復(fù)性當(dāng)變性因素除去后，變性蛋白質(zhì)又重新回復(fù)到天然構(gòu)象的現(xiàn)象成為蛋白質(zhì)的復(fù)性。蛋白質(zhì)變性后的特性：生物活

6、性喪失、側(cè)鏈基團(tuán)暴露、理化性質(zhì)改變、生化性質(zhì)改變五、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)反應(yīng)名稱試劑顏　色反應(yīng)有關(guān)基團(tuán)雙縮脲反應(yīng)NaOH、CuSO2紫色或粉紅色二個(gè)以上肽鍵酚試劑反應(yīng)堿性CuSO4及磷鎢酸-鉬酸藍(lán)色酚基、吲哚基茚三酮反應(yīng)茚三酮藍(lán)色自由氨基及羧基第二節(jié)　蛋白質(zhì)的分離純化一、蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟1.蛋白質(zhì)樣品的前處理2.蛋白質(zhì)粗提液的粗分級(jí)分離3.濃縮蛋白質(zhì)的細(xì)分級(jí)分離4.蛋白質(zhì)的結(jié)晶二、蛋白質(zhì)的分離純化方法主要是根據(jù)蛋白質(zhì)在溶液中的性質(zhì)不同對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。分子大小溶解度電荷吸附性質(zhì)對(duì)配體分子的生物學(xué)親和力（一）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的純化方法主要方法：1：透

7、析（dialysis）和超過(guò)濾（ultrafiltration）2：密度梯度（區(qū)帶）離心3：凝膠過(guò)濾法1：透析和超過(guò)濾（利用蛋白質(zhì)分子不能通過(guò)半透膜的性質(zhì)）透析流程透析裝置超過(guò)濾裝置使用壓力或者離心力使蛋白質(zhì)溶液透過(guò)有一定截留分子量的超濾膜（半透膜），達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。?裝好具備密度梯度的介質(zhì)溶液?離心?收集分離后的各組分?加入：混和蛋白質(zhì)樣品離心裝置2：密度梯度（區(qū)帶）離心3：凝膠過(guò)濾法凝膠過(guò)濾是按照蛋白質(zhì)分子大小進(jìn)行分離的技術(shù)，又稱凝膠層析、分子篩層析或排阻層析。凝膠過(guò)濾法是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物