實(shí)驗(yàn)一 植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測(cè)定

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1、實(shí)驗(yàn)一植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測(cè)定一、目的在逆境條件下（旱、熱、冷、凍），植物體內(nèi)脯氨酸的含量顯著增加，植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種積累的脯氨酸多。因此測(cè)定脯氨酸含量可以作為抗旱育種的生理指標(biāo)。另外，由于脯氨酸親水性極強(qiáng)，能穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及組織內(nèi)的代謝過(guò)程，因而能降低冰點(diǎn)，有防止細(xì)胞脫水的作用。在低溫條件下，植物組織中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作為抗寒育種的生理指標(biāo)。二、原理磺基水楊酸對(duì)脯氨酸有特定反應(yīng)，當(dāng)用磺基水楊酸提取植物樣品時(shí)，脯氨酸便游離于磺基水楊酸溶液中。然后用酸性茚三酮加

2、熱處理后，茚三酮與脯氨酸反應(yīng)，生成穩(wěn)定的紅色化合物，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出脯氨酸的含量。三、材料、儀器及試劑1.材料：植物葉片。2.儀器：分光光度計(jì)；電子分析天平；離心機(jī)；小燒杯；普通試管；移液管；注射器；恒溫水浴鍋；漏斗；漏斗架；濾紙；剪刀；洗耳球。3.試劑及配制：2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol·L－1磷酸中，攪拌加熱（70℃）溶解，貯于冰箱中。3％磺基水楊酸配配制：3g磺基水楊酸加

3、蒸餾水溶解后定容至100ml。10μg·ml-1脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)母液配制：精確稱取20mg脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度（為100μg·ml－1脯氨酸母液），再吸取該溶液10ml,加蒸餾水稀釋定容至100ml,即為10μg·ml-1脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。冰醋酸；甲苯。四、實(shí)驗(yàn)步驟1.?????脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1.1取6支試管，編號(hào)，按下表配制每管含量為0～12μg的脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。加入表中試劑后，置于沸水浴中加熱30min。取出冷卻，各試管再加入4ml甲苯，振蕩30秒鐘，靜置片刻，使色素全部轉(zhuǎn)

4、至甲苯溶液。試劑管號(hào)01234510μg·ml-1脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液（ml）蒸餾水（ml）冰醋酸（ml）2.5﹪酸性茚三酮（ml）02220.21.8220.41.6220.61.4220.81.2221.01.022每管脯氨酸含量（μg）02468101.2用注射器輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液為空白對(duì)照，在520mm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值。1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以1～5號(hào)管脯氨酸含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.樣品的測(cè)定2.1脯氨酸的提取稱取不同處理的植物葉片各0.5g，分別置大試管中，然后向各管

5、分別加入5ml3％的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取過(guò)程中要經(jīng)常搖動(dòng)），冷卻后過(guò)濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。2.2測(cè)定吸取2ml提取液于帶玻塞試管中，加入2ml冰醋酸及2ml2.5﹪酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱30min，溶液即呈紅色。冷卻后加入4ml甲苯，搖蕩30秒鐘，靜置片刻，取上層液至10ml離心管中，在3000r/min離心5min。用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液為空白對(duì)照，在520mm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值。五、計(jì)算結(jié)果從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品測(cè)定液中脯氨酸的含量，按下

6、公式計(jì)算樣品中脯氨酸含量：X×提取液總量（ml）脯氨酸含量（μg·g－1Fw）＝———————————————————樣品鮮重（g）×測(cè)定時(shí)提取液用量（ml）公式中：X－從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的脯氨酸含量（μg）五、注意事項(xiàng):1.配置的酸性茚三酮溶液僅在24h內(nèi)穩(wěn)定，因此最好現(xiàn)用現(xiàn)配。2.測(cè)定樣品若進(jìn)行過(guò)滲透脅迫處理，結(jié)果會(huì)更顯著。3.試劑添加次序不能出錯(cuò)。